Cuento de células viables
Hay varias formas de enumerar el número de bacterias en una muestra. El recuento de células viables permite identificar el número de células que crecen o se dividen activamente en una muestra. El método de recuento en placa o placa de dispersión se basa en el crecimiento de una colonia de bacterias en un medio nutritivo. La colonia se hace visible a simple vista y se puede contar el número de colonias en una placa. Para que sea eficaz, la dilución de la muestra original debe estar dispuesta de forma que, por término medio, crezcan entre 30 y 300 colonias de la bacteria objetivo. Menos de 30 colonias hace que la interpretación no sea estadísticamente sólida y más de 300 colonias suele dar lugar a la superposición de colonias y a la imprecisión del recuento. Para garantizar que se genere un número adecuado de colonias, normalmente se cultivan varias diluciones. El procedimiento de laboratorio consiste en hacer diluciones en serie de la muestra (1:10, 1:100, 1:1000, etc.) en agua estéril y cultivarlas en agar nutritivo en una placa que se sella y se incuba. Los medios típicos incluyen el agar Plate count para un recuento general o el agar MacConkey para el recuento de bacterias gramnegativas como E. coli. Normalmente, un juego de placas se incuba a 22°C y durante 24 horas y un segundo juego a 37°C durante 24 horas. La composición del nutriente suele incluir reactivos que resisten el crecimiento de organismos no objetivo y hacen que el organismo objetivo sea fácilmente identificable, a menudo por un cambio de color en el medio. Algunos métodos recientes incluyen un agente fluorescente para poder automatizar el recuento de las colonias. Al final del periodo de incubación, las colonias se cuentan a ojo, un procedimiento que lleva unos instantes y que no requiere un microscopio, ya que las colonias suelen tener unos pocos milímetros de diámetro.
El método de la placa de vertido se utiliza cuando el análisis busca especies bacterianas que crecen mal en el aire. El análisis inicial se realiza mezclando diluciones en serie de la muestra en agar nutritivo líquido que luego se vierte en frascos. A continuación, los frascos se sellan y se colocan de lado para producir una superficie de agar inclinada. Las colonias que se desarrollan en el cuerpo del medio pueden contarse a ojo tras la incubación. El número total de colonias se denomina recuento total viable (TVC). La unidad de medida es ufc/ml (o unidades formadoras de colonias por mililitro) y se refiere a la muestra original. Su cálculo es un múltiplo del número de colonias contadas multiplicado por la dilución utilizada. Ejemplos de recuento de células viables son las placas de dispersión a partir de una dilución en serie de un cultivo líquido y las placas de vertido. Con una placa de dispersión se hacen diluciones en serie en medios líquidos y luego se extiende un volumen conocido del último tubo de la serie de diluciones. A continuación, se pueden contar las colonias en la placa y calcular la concentración de bacterias en el cultivo original. En el método de la placa de vertido, se mezcla una muestra bacteriana diluida con agar fundido y luego se vierte esa mezcla en una placa de Petri. De nuevo se cuentan las colonias y se calcula el recuento de células viables.