Análisis y descripción de los estadios de formación de biopelículas de Aspergillus fumigatus mediante microscopía electrónica de barrido

Desde el punto de vista médico, Aspergillus fumigatus es un patógeno oportunista de individuos inmunodeprimidos, con una gravedad de la enfermedad que depende del estado inmunitario del huésped, demostrando una tasa de mortalidad del 50-95 %. Este hongo da lugar a infecciones locales, como las dermatomicosis de las uñas o las queratitis fúngicas, y a infecciones invasivas, como la aspergilosis, y constituye la segunda causa más común de infecciones fúngicas en pacientes hospitalizados. La infección por A. fumigatus en el tracto respiratorio puede causar una bola fúngica pulmonar, aspergilosis invasiva, aspergilosis pulmonar invasiva (IPA), neumonitis por hipersensibilidad, asma, rinitis alérgica mediada por inmunoglobulina E, neumonía necrotizante crónica o aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA). Además, da lugar a osteomielitis y endocarditis.

A. fumigatus desarrolla una biopelícula que puede ser uno de los factores de virulencia más importantes . El biofilm de A. fumigatus elabora micelios incrustados en un EMC in vitro, y la formación de biofilm se ha descrito en células epiteliales bronquiales humanas (HBE) y en células epiteliales bronquiales de fibrosis quística (CFBEC) y en pacientes con fibrosis quística . La formación de biopelículas fúngicas en catéteres y prótesis contribuye al desarrollo de infecciones nosocomiales. Por lo tanto, la persistencia de las infecciones fúngicas se debe a la capacidad del hongo de formar biofilms en una amplia variedad de dispositivos médicos y a que las células persistentes representan un importante mecanismo de resistencia. El tratamiento sometido a una biopelícula establecida en el huésped suele requerir la administración de concentraciones tóxicas de antimicrobianos, y el tratamiento recomendado incluye la retirada del dispositivo contaminado; sin embargo, éste es un proceso difícil y costoso. Por lo tanto, las biopelículas fúngicas son un problema clínico y económico importante.

En la última década, se han publicado varios estudios sobre la biopelícula de A. fumigatus, tanto in vivo (en modelos murinos, en pacientes con aspergilosis pulmonar invasiva y en cultivos epiteliales humanos primarios) como in vitro (en placas de poliestireno). En general, estos estudios se refieren principalmente a la etapa de madurez de la biopelícula y a la composición química de la MEC, con pocas imágenes de las etapas de la biopelícula, pero cualquiera de ellas describe todas las etapas de la formación de la biopelícula. Por lo tanto, la información es diferente de las contribuciones realizadas por nuestro grupo de trabajo.

Las contribuciones más importantes de este estudio son las siguientes: i) proporcionamos una descripción de todas las etapas de la formación de biofilm de A. fumigatus in vitro, a lo largo del tiempo, y las etapas se apoyan con imágenes de MEB; ii) analizamos dos orígenes diferentes de los aislados: uno del medio ambiente y otro de un paciente con úlcera corneal; iii) informamos sobre microhifas (aislado clínico) y estructuras fúngicas que han sido escasamente reportadas hasta la fecha y que no han sido descritas, hasta donde sabemos, para la especie Aspergillus; y iv) proporcionamos una descripción del paso de dispersión para la formación de la colonización del biofilm en nuevos puntos.

Para analizar la organización estructural de la biopelícula madura de A. fumigatus (24 h de incubación a 28 °C y 37 °C), se examinaron por MEB dos cepas, una del suelo y otra de un paciente con queratitis fúngica. Una visión general de la formación de biofilms de A. fumigatus observada en esta investigación fue que estos biofilms se comportaron de forma similar independientemente de si el aislado procedía del suelo o de la clínica; sin embargo, se presentaron diferencias según la temperatura de incubación. A 28 °C, la biopelícula mostró etapas similares a las descritas en el crecimiento microbiano clásico: las fases de retardo, exponencial y estacionaria; el crecimiento de la biopelícula fue lento y estable con una baja producción de ECM, y la organización estructural fúngica fue simple (Fig. 1). A 37 °C, la curva de rendimiento mostró una fase lag (adaptación) y log (exponencial) bastante variable, que podría ser una respuesta al estrés debido a la incubación a alta temperatura; así, a 37 °C hay una reducción de la fase de adaptación (lag) para mantener el hongo viable; también, la fase log, con un aumento discontinuo y con ambos comportamientos es probablemente una respuesta adaptativa . Así, a 37 °C, durante la fase de maduración, había estructuras miceliales extremadamente organizadas, y éstas estaban reducidas y compactadas con hifas engrosadas y fusionadas en anastomosis, y la MEC era abundante en su cobertura, rodeando y reforzando las estructuras fúngicas (Figs. 3 y 4).

En este estudio, proporcionamos pruebas de las etapas de la biopelícula de A. fumigatus mediante SEM. Las etapas observadas durante la formación de la biopelícula fueron las siguientes:

Adherencia, coagregación celular y producción de EPS

En una etapa temprana (Fig. 2/4 h), los conidios se adhieren a la superficie de la placa mediante una interacción de fuerzas electrostáticas entre los componentes estructurales de la pared celular del hongo, y esta fuerza de atracción es débil y, por tanto, reversible. La unión irreversible y permanente ha sido ampliamente descrita en las adhesinas bacterianas específicas presentes en la superficie de la célula, que se unen al sustrato y al EPS, que son sustancias producidas por el microorganismo en las etapas iniciales de la formación de la biopelícula que funcionan en la adhesión de las células entre sí y al sustrato y están compuestas por complejos de proteínas-carbohidratos y glicoproteínas que desempeñan principalmente funciones estructurales o adhesivas. Las adhesinas están implicadas en el reconocimiento de las células bacterianas entre sí, incluyendo la construcción de puentes y el inicio de la formación de colonias . Las adhesinas están descritas en la adhesión de hongos durante la formación de biopelículas. En las biopelículas de Candida albicans, Candida glabrata y Candida tropicalis, hay un grupo de genes de adhesión implicados en la formación de biopelículas que pertenecen a la familia de secuencias similares a las aglutininas (ALS), que desempeña un papel clave en este proceso y codifica proteínas que poseen las características de las glicoproteínas de las adhesinas en la superficie celular. La familia ALS presente en C. albicans incluye ocho genes (ALS1-ALS7 y ALS9) que codifican muchas glicoproteínas de superficie. En A. fumigatus, se han identificado seis hidrofobinas, que comprenden las varillas RodAp, RodBp, RodCp, RodDp, RodEp y RodFp, en la superficie de los conidios. Esta característica hidrofóbica permite la adhesión a las proteínas de las células del hospedador, y podrían estar implicadas en la adhesión a la superficie de la placa de poliestireno y en el inicio del proceso de formación de la biopelícula en todas o sólo en dos o tres de ellas. Además, Gravelat y colaboradores describieron esta interacción fúngica, y descubrieron que la adhesina MedA controla la adherencia a la placa de poliestireno, la formación de biopelículas y la expresión de genes de conidiación, y que tiene efectos duros en el proceso de conidiación en A. fumigatus . La adhesión, resultante de la interacción entre las adhesinas del hongo y la superficie de la placa, y la adhesión conidio-conidio probablemente desencadena la señalización y promueve la coagregación celular y la producción de EPS, y estos eventos se presentan en la Fig. 2 (4 h). Al mismo tiempo, el EPS acelera la formación de colonias de hongos mediante la unión estrecha de las células (Fig. 2 (8-12 h)) .

La germinación de los conidios en hifas y el desarrollo

La formación de biopelículas requiere un número umbral de células que les permita ser detectadas y generar una respuesta, que es un mecanismo regulador de la expresión génica con funciones específicas . En la formación de biopelículas de A. fumigatus, antes de comenzar la germinación de las conidias, la superficie de éstas es marcadamente hidrofóbica y está compuesta por un 40 % de grupos metilo hidrofóbicos. La germinación de los conidios de A. fumigatus provoca la ruptura de la capa proteínica hidrofóbica y revela las paredes internas de los conidios que están compuestas esencialmente por polisacáridos, que son componentes hidrofílicos de la pared celular. Hay una punta hidrofóbica en una sola espora en germinación. El conidio pierde progresivamente su hidrofobicidad superficial y, después, el nuevo punto de crecimiento presenta una coexistencia de bastoncillos hidrofóbicos y polisacáridos hidrofílicos . La germinación de las conidias en hifas comienza con la formación de tubos germinales, como se ilustra en la Fig. 2 (8-12 h), que poseen la naturaleza muy hidrofílica de la pared celular, y se espera que favorezcan el crecimiento de las hifas .

Maduración de la biopelícula

La maduración de la biopelícula de A. fumigatus se observó a las 24 h, que es un tiempo de incubación similar a los reportados por otros investigadores. Los componentes estructurales incluyen la ECM, que está presente en el biofilm maduro y une las células para formar la base estructural del biofilm, incluyendo el EPS y muchos micelios organizados (Fig. 2 (24 h0) . ECM. El agua es el componente más abundante y, en la biopelícula, es casi el 97%. En este entorno húmedo, existe una red macromolecular ordenada. Las principales funciones descritas para el EPS en las biopelículas bacterianas son las siguientes: adhesión, agregación celular, cohesión; retención de agua, barrera protectora como defensas específicas del huésped o agentes antimicrobianos, absorción de compuestos orgánicos e iones inorgánicos, actividad enzimática, fuente de nutrientes, intercambio de información genética, donante o aceptor de electrones, exportación de componentes celulares, almacenamiento del exceso de retención de energía y estabilización de enzimas. En las biopelículas fúngicas aún no se han descrito todas estas funciones, pero se están estudiando algunas de ellas: las fuerzas cohesivas y adhesivas de la matriz contribuyen a la estabilidad arquitectónica y mecánica de la biopelícula. Las células fúngicas están inmovilizadas en la matriz y actúan como un ecosistema en funcionamiento en continuo cambio y regulación homeostática con intensas interacciones, incluida la comunicación célula-célula, que actúa como el pegamento que mantiene unidas a las células . La estructura del biofilm varía mucho según el microorganismo que lo produce y las condiciones que rodean sus microhábitats, incluyendo las diferencias estructurales asociadas a la presentación clínica. Durante los procesos infecciosos, la MEC apoya la protección contra el huésped, así como la resistencia a los fármacos por parte de los microorganismos; por tanto, la MEC no es sólo un marco mecánico, sino que también es un regulador del comportamiento celular. Las proteínas hidrofóbicas de la matriz se unen a los receptores específicos de la superficie celular que dan lugar a la adhesión célula-matriz, que ejerce un efecto sobre la forma, la migración, la proliferación, la supervivencia y el metabolismo de las células. Además, la MEC protege a las células contra las agresiones ambientales, como la desecación, los rayos ultravioleta (UV), la radiación, la oxidación, la inanición, la acción de los depredadores y las defensas inmunitarias del huésped y los antibióticos. Las características de la MEC eran evidentes en la Fig. 2 (24 h) y en la Fig. 3 y se adherían a las hifas fúngicas en una vaina contigua y también se observaba una consistencia porosa (Fig. 2 (24 h)). En la biopelícula de A. fumigatus, el EPS tenía una gran disposición estructural y una producción abundante, que cubría, rodeaba y reforzaba las estructuras fúngicas; actúa como cohesivo para la fusión de las estructuras hifas (sólo a 37 °C). El EPS se presenta con un aspecto mucoso que se adhiere completamente y cubre las hifas, provocando anastomosis y cerrando el lumen de los canales de agua (Figs. 2 (24 h), 3 y 4). En estudios anteriores, nuestro grupo de trabajo describió la etapa de maduración de la biopelícula de A. fumigatus, en la que se observaron estructuras similares.

En algunos microconsorcios se conoce la composición química del EPS (polímeros de carbohidratos, ADN y/o proteínas y, lípidos, entre otros) pero otros quedan por identificar. La superficie de A. fumigatus está compuesta por α-1,3-glucanos, quitina, quitosano, galactomanano, galactosaminogalactano, melanina y proteínas. La composición y la organización estructural de la pared celular se modifican constantemente; aunque los polisacáridos presentes son los mismos, su cantidad y localización varían con las condiciones de crecimiento y el entorno nutricional. Aquí mostramos la composición química de la biopelícula de A. fumigatus, que se observó mediante la co-localización de los fluorocromos unidos a la quitina, la actividad metabólica y los ácidos nucleicos por CLSM; además, se observó el solapamiento de las señales de los fluorocromos cuando estos se unían a dos o tres de estos (Fig. 5). La función descrita para los polisacáridos, como los α 1,3-glucanos, comprendía su papel predominante in vitro en la agregación hifal y en la agregación hifal en las biopelículas. También se sabe que otros polisacáridos de la MEC, como el galactomanano y el galactosaminogalactano, tienen un papel en la protección del hongo y en la adhesión de sus estructuras de biopelícula a las superficies . El ADN extracelular (ADNe) es un componente importante de la biopelícula ECM que mantiene la integridad estructural y arquitectónica de A. fumigatus. El ADNe se crea por autolisis y se ha asociado significativamente con los niveles de resistencia a los antifúngicos (Fig. 5). Además, el ADNe puede ser un reservorio de genes para la transferencia horizontal de genes. El ADNe confiere una organización estructural más sólida y resistente cuando se co-localiza con polisacáridos. El ADNe deriva de las células fúngicas debido a la secreción de quitinasas por parte de A. fumigatus favoreciendo su liberación (Fig. 5) . En el biofilm, la modificación de la pared celular ejerce un impacto esencial en la resistencia a los fármacos de la pared celular. En A. fumigatus, en un modelo de biofilm de ratón, en las bombas de eflujo resistentes a múltiples fármacos (MDR) los genes AfuMDR4 asociados a la salida de antimicrobianos, el gen fue significativamente inducido por el tratamiento con Voriconazol después de 24 h . El marcador FUN1 reveló una actividad metabólica que es una comunidad viva (Fig. 5).

Micelios: La biopelícula muestra una compleja estructura tridimensional (3-D) que refleja un proceso celular coordinado; el desarrollo y la expansión del micelio eran evidentes, lo que incluía redes compactas de estratificación de hifas, adhesión de hifas, anastomosis a ambas temperaturas, con canales formados por una disposición espacial óptima para proporcionar la entrada de nutrientes y la salida de productos de desecho y, por tanto, estabilizar la biopelícula; a 37 °C, este canal era más evidente (Figs. 2 (24 h), 3 y 4). Además, estas estructuras fueron observadas por otros investigadores . Microhifas: En las primeras etapas de maduración de la biopelícula, se observaron estructuras fúngicas irregulares, como las microhifas, en el aislado clínico (Fig. 4). Este hecho es relevante porque hay escasas referencias a las microhifas en la literatura, y esta es la primera vez que se describen en A. fumigatus. Las microhifas presentan alteraciones del citoesqueleto que generan hifas cortas y delgadas con paredes finas y con extremos doblados. Las microhifas están asociadas a una elevada actividad enzimática que favorece el proceso de maduración y la posterior dispersión celular de la fase de biofilm.

Dispersión celular

Durante la dispersión celular se desprende una porción del biofilm, la que comprende los conidios o las hifas. Se observó un desarrollo asíncrono de la biopelícula, especialmente en la fase de maduración de la misma, cuando los nuevos conidios eran capaces de germinar, produciendo un nuevo crecimiento micelial y modificaciones en las hifas, como los rizos (Figs. 4 y 6). La dispersión celular de la biopelícula se produce en respuesta a los cambios ambientales. Esto actúa para eliminar una sustancia peligrosa del cuerpo principal de la biopelícula. Este proceso conduce a la diseminación y propagación de las células del biofilm en una nueva ubicación, lo que es apoyado por complejos eventos moleculares . Las biopelículas pueden considerarse como cáscaras protectoras de las células vivas que hay debajo, con funciones extremadamente complejas e innumerables, por lo que se trata de construcciones biológicas realmente notables. Las biopelículas ofrecen protección contra la depredación o el ataque químico y proporcionan a las células internas un medio para la comunicación intracelular, el flujo de nutrientes y la transferencia de material genético. La dispersión celular disemina las células viables a otros lugares del entorno o dentro de un huésped donde las células pueden reproducirse, facilitando así su persistencia. La dispersión celular se produce como consecuencia de la escasez de nutrientes en el medio ambiente y, por tanto, es un mecanismo de supervivencia. Por lo tanto, la dispersión celular es importante no sólo para promover la diversidad genética, sino también para escapar de hábitats desfavorables, ayudando al desarrollo de nuevos nichos y a la persistencia del microorganismo en una nueva localización.