Specimen Requirements and Procedure
Los ELISAs se realizan en placas de poliestireno, típicamente en placas de 96 pocillos recubiertas para unir proteínas muy fuertemente. Dependiendo del tipo de ELISA, la prueba requiere un anticuerpo de detección primario y/o secundario, analito/antígeno, anticuerpo/antígeno de recubrimiento, tampón, lavado y sustrato/cromógeno. El anticuerpo de detección primario es un anticuerpo específico que sólo se une a la proteína de interés, mientras que un anticuerpo de detección secundario es un segundo anticuerpo conjugado con enzimas que se une a un anticuerpo primario que no está conjugado con enzimas.
Hay cuatro pasos generales principales para completar un inmunoensayo ELISA. Estos pasos son:
-
Recubrimiento (con antígeno o anticuerpo)
-
Bloqueo (normalmente con la adición de albúmina de suero bovino )
-
Detección
-
Lectura final
La detección se realiza mediante la adición de un sustrato que pueda generar un color. Hay muchos sustratos disponibles para su uso en la detección de ELISA. Sin embargo, los más utilizados son la peroxidasa de rábano picante (HRP) y la fosfatasa alcalina (ALP). El sustrato para la HRP es el peróxido de hidrógeno y da lugar a un cambio de color azul. La ALP mide el color amarillo del nitrofenol después de periodos de incubación a temperatura ambiente de 15 a 30 minutos y suele utilizar el P-nitrofenil-fosfato (pNPP) como sustrato.
Entre cada uno de los cuatro pasos anteriores se realiza un «lavado» de la placa utilizando un tampón, como la solución salina tamponada con fosfato (PBS) y un detergente no iónico, para eliminar el material no unido. Los pocillos se lavan dos o más veces durante cada paso de lavado, dependiendo del protocolo específico que se siga.
En el protocolo ELISA, normalmente, se coloca una dilución en serie de concentraciones en los pocillos de la placa. Una vez medidos los resultados, se traza una curva estándar a partir de los datos de las diluciones en serie con una concentración en el eje x utilizando una escala logarítmica y una absorbancia en el eje y utilizando una escala lineal.
Hay cuatro tipos principales de ELISA:
-
ELISA directo (placa recubierta de antígeno; cribado de anticuerpos)
-
ELISA indirecto (placa recubierta de antígeno; cribado de antígeno/anticuerpo)
-
Sandwich ELISA (placa recubierta de anticuerpos;
-
ELISA competitivo (cribado de anticuerpos)
ELISA directo
Tanto el ELISA directo como el indirecto comienzan con el recubrimiento del antígeno en las placas de ELISA. El primer paso de unión consiste en añadir el antígeno a las placas, que se incuba durante una hora a 37 grados C o puede incubarse a 4 grados C durante la noche. Una vez completado el paso de incubación, el siguiente paso es lavar las placas de cualquier anticuerpo potencialmente no unido y bloquear cualquier sitio no unido en la placa ELISA usando agentes como BSA, ovoalbúmina, aprotinina u otras proteínas animales. Este segundo paso es importante porque evita la unión de cualquier anticuerpo no específico a la placa y minimiza los resultados falsos positivos. Tras añadir el tampón, se vuelve a lavar la placa y se añade un anticuerpo primario de detección seleccionado conjugado con enzimas. La placa se incuba durante una hora más.
En un ELISA directo, el anticuerpo de detección primario se une directamente a la proteína de interés. A continuación, se vuelve a lavar la placa para eliminar cualquier anticuerpo no unido y se añade un sustrato/cromóforo, como la fosfatasa alcalina (AP) o la peroxidasa de rábano picante (HRP) a la placa, lo que provoca un cambio de color. El cambio de color de la muestra se produce por la hidrólisis de los grupos fosfato del sustrato por la AP o por la oxidación de los sustratos por la HRP. Las ventajas de utilizar el ELISA directo incluyen la eliminación de la reactividad cruzada de los anticuerpos secundarios y, debido al menor número de pasos, es rápido en comparación con el ELISA indirecto. Sus desventajas incluyen su baja sensibilidad en comparación con los otros tipos de ELISA y su alto coste de reacción.
ElISA indirecto
Los pasos del ELISA indirecto son idénticos a los del ELISA directo, excepto por un paso de lavado adicional y los tipos de anticuerpos que se añaden después de eliminar el tampón. El ELISA indirecto requiere dos anticuerpos, un anticuerpo primario de detección que se adhiere a la proteína de interés y un anticuerpo secundario ligado a enzimas complementario al anticuerpo primario. El anticuerpo primario se añade primero, seguido de un paso de lavado, y luego se añade el anticuerpo secundario conjugado con enzimas y se incuba. Después, los pasos son los mismos que los del ELISA directo, que incluyen un paso de lavado, la adición de sustrato y la detección de un cambio de color.
El ELISA indirecto tiene una mayor sensibilidad en comparación con el ELISA directo. También es menos costoso y más flexible debido a los numerosos anticuerpos primarios que pueden utilizarse. La única desventaja importante de este tipo de ELISA es el riesgo de reactividad cruzada entre los anticuerpos de detección secundarios.
ElISA en sándwich
A diferencia del ELISA directo e indirecto, el ELISA en sándwich comienza con un anticuerpo de captura recubierto en los pocillos de la placa. Se denomina «sándwich» porque los antígenos se encuentran entre dos capas de anticuerpos (anticuerpos de captura y de detección). Tras añadir el anticuerpo de captura a las placas, éstas se cubren y se incuban durante la noche a 4°C. Una vez completado el paso de recubrimiento, las placas se lavan con PBS y luego se tamponan/bloquean con BSA. Los lavados con tampón se realizan durante al menos 1-2 horas a temperatura ambiente. Finalmente, la placa se lava con PBS una vez más antes de la adición del antígeno.
El antígeno de interés se añade entonces a las placas para que se una al anticuerpo de captura y se incuba durante 90 minutos a 37 grados C. La placa se vuelve a lavar, y el anticuerpo de detección primario se añade entonces a la placa y se incuba durante otras 1 o 2 horas a temperatura ambiente, seguido de un lavado con tampón. A continuación se añade el anticuerpo secundario conjugado con enzimas y se incuba durante 1 ó 2 horas más. Se vuelve a lavar la placa y se añade el sustrato para producir un cambio de color. El ELISA en sándwich tiene la mayor sensibilidad entre todos los tipos de ELISA. Las principales desventajas de este tipo de ELISA son el tiempo y el gasto, así como el uso necesario de anticuerpos secundarios y de «par emparejado» (antígeno divalente/multivalente).
El ELISA competitivo
El ELISA competitivo comprueba la presencia de un anticuerpo específico para los antígenos en el suero de la prueba. Este tipo de ELISA utiliza dos anticuerpos específicos, un anticuerpo conjugado con enzimas y otro anticuerpo presente en el suero de prueba (si el suero es positivo). La combinación de los dos anticuerpos en los pocillos permitirá una competencia por la unión al antígeno. La presencia de un cambio de color significa que la prueba es negativa porque el anticuerpo conjugado con la enzima se unió a los antígenos (no a los anticuerpos del suero de prueba). La ausencia de color indica una prueba positiva y la presencia de anticuerpos en el suero de la prueba. El ELISA competitivo tiene una baja especificidad y no puede utilizarse en muestras diluidas. Sin embargo, las ventajas son que se necesita menos purificación de la muestra, puede medir una amplia gama de antígenos en una muestra dada, puede utilizarse para antígenos pequeños y tiene una baja variabilidad.