Conversión de ARNm en ADNc de doble cadena

La conversión enzimática de ARNm en ADN de doble cadena de inserción puede llevarse a cabo mediante varios procedimientos diferentes. Todos ellos implican la acción de la transcriptasa inversa y la síntesis de ADNc cebado con oligonucleótidos. A partir de ahí, los procedimientos de uso común divergen considerablemente. Existen varios métodos para sintetizar la segunda cadena y varios procedimientos para producir extremos adecuados para hacer ADN clonable. Los principales objetivos de estos procedimientos son construir un ADN de inserción lo más largo posible, con un alto rendimiento de conversión de ARNm en ADN que pueda ligarse al ADN del vector. Los siguientes protocolos sólo requieren reactivos disponibles en el mercado y suelen tener éxito en la producción de buenas bibliotecas de ADNc. El protocolo básico describe un método para hacer ADNc con punta roma que luego puede ligarse a enlazadores para su posterior clonación en un sitio de restricción único como EcoRI. El protocolo alternativo es una variación que requiere menos manipulaciones enzimáticas y permite la construcción de bibliotecas de ADNc direccionales, que son particularmente deseables cuando el objetivo es generar bibliotecas de ADNc de expresión. El protocolo alternativo aprovecha un cebador enlazador que consiste (en orden de 3′ a 5′) en un cebador oligo(dT), un sitio de restricción para la endonucleasa XhoI y una repetición (GA)20 para proteger el sitio de restricción durante la generación del ADNc despuntado. Los sitios XhoI internos en las moléculas individuales de ADNc están protegidos por la incorporación de 5-metil-dCTP en la mezcla de nucleótidos de la primera cadena. Los ADNc resultantes con extremos únicos pueden clonarse en vectores digeridos por EcoRI /XhoI tras la ligación de adaptadores EcoRI al extremo 5′ y la digestión por XhoI para liberar los sitios 3′ XhoI que fueron incorporados al ADNc por el linker-primer. Estos cambios dan como resultado un procedimiento considerablemente racionalizado que es sustancialmente más rápido y fácil que el protocolo básico.