- Co zvolit pro studium mikrobiomu
- Co je sekvenování genu 16S rRNA?
- Co je to metagenomické sekvenování?
- 16S/ITS sekvenování vs. metagenomické sekvenování. shotgun metagenomické sekvenování
- Taxonomické rozlišení
- Funkční profilování
- Mikrobiální pokrytí a doporučený typ vzorku
- False positives
- Rušení hostitelskou DNA
- Vstupní DNA
- Pomůžeme vám
- Zjistěte, která metoda sekvenování je pro vás nejlepší. Obraťte se na odborníky poskytující sekvenační služby ZymoBIOMICS.
Co zvolit pro studium mikrobiomu
16S sekvenování nebo shotgun sekvenování? Tuto otázku si kladou téměř všichni výzkumníci mikrobiomu, když plánují novou studii, protože naprostá většina publikací o mikrobiomu využívá buď sekvenování genů 16S rRNA, nebo shotgun metagenomické sekvenování k získání surových dat pro následné mikrobiální profilování nebo metagenomické analýzy. Každá metoda má svá pro a proti, takže jakou metodu byste si měli vybrat?
Co je sekvenování genu 16S rRNA?
Sekvenování genu 16S rRNA nebo jednoduše sekvenování 16S využívá PCR k cílení a amplifikaci částí hypervariabilních oblastí (V1-V9) bakteriálního genu 16S rRNA1. Amplikony z jednotlivých vzorků jsou pak opatřeny molekulárními čárovými kódy, spojeny dohromady a sekvenovány. Po sekvenování se nezpracovaná data analyzují pomocí bioinformatické pipeline, která zahrnuje ořezávání, korekci chyb a porovnání s referenční databází 16S. Po přiřazení čtení k fylogenetickému ranku lze vytvořit taxonomický profil. Podobně sekvenování ITS se řídí stejnou strategií, ale zaměřuje se na oblast ITS (Internal transcribed spacer), která se nachází v genomech hub.
Co je to metagenomické sekvenování?
Na rozdíl od sekvenování 16S, které se zaměřuje pouze na geny 16S rRNA, sekvenuje metagenomické sekvenování veškerou danou genomickou DNA ze vzorku. Pracovní postup přípravy knihovny je podobný jako u běžného sekvenování celého genomu, včetně náhodné fragmentace a ligace adaptérů. Typický pracovní postup pro taxonomickou analýzu shotgun metagenomických dat zahrnuje ořezání kvality a porovnání s referenční databází obsahující celé genomy (např. Kraken2 a Centrifuge3) nebo vybrané markerové geny (MetaPhlAn4 a mOTU5) za účelem vytvoření taxonomického profilu. Vzhledem k tomu, že shotgun metagenomické sekvenování pokrývá veškerou genetickou informaci ve vzorku, lze data použít pro další analýzy, např. metagenomické sestavení a binning, profilování metabolických funkcí a profilování genů rezistence vůči antibiotikům.
16S/ITS sekvenování vs. metagenomické sekvenování. shotgun metagenomické sekvenování
Pokud vaše studie vyžaduje genomické analýzy nad rámec profilování taxonomie, například analýzu metabolických drah, měli byste zvážit shotgun metagenomické sekvenování vzhledem k jeho většímu genomickému pokrytí a výstupu dat. Pokud je hlavním účelem studie profilování složení, obě techniky mají výhody a nevýhody, které je třeba zvážit (tabulka 1).
.
.
Taxonomické rozlišení
Taxonomické rozlišení sekvenování 16S/ITS závisí na cílových variabilních oblastech, samotném organismu a algoritmu sekvenační analýzy. V posledních letech některé metody korekce chyb, např. metoda DADA26 , výrazně zlepšily přesnost a taxonomické rozlišení této techniky. Díky DADA2 je nyní rozlišení na úrovni druhu pro mnoho organismů pomocí běžného sekvenování 16S realitou. Teoreticky však může shotgun metagenomické sekvenování dosáhnout rozlišení na úrovni kmene, protože může pokrýt všechny genetické variace. Ačkoli v praxi se přesnost rozlišení na úrovni kmene stále potýká s technickými problémy. I tak ale shotgun metagenomické sekvenování dosahuje vyššího rozlišení ve srovnání se sekvenováním 16S/ITS.
Funkční profilování
Pokud je cílem analýza metabolických funkcí, většina výzkumníků sekvenování 16S a ITS rychle přehlédne. Existují však některé nástroje, které dokáží odvodit metabolickou funkci z taxonomických dat, například PICRUSt7. Obecně se však brokové metagenomické sekvenování často využívá, pokud je požadováno funkční profilování, a to kvůli dodatečnému pokrytí genů.
Mikrobiální pokrytí a doporučený typ vzorku
Brokové sekvenování zkoumá veškerou metagenomickou DNA, zatímco sekvenování 16S pouze geny 16S rRNA, které také trpí neúplným pokrytím primerů. V důsledku toho má první z nich větší pokrytí napříč doménami. Proč je tedy v tabulce 1 označeno sekvenování 16S/ITS jako lepší v pokrytí bakterií a hub? To vyplývá z druhového pokrytí dostupných referenčních databází, protože predikce taxonomie těchto sekvenačních přístupů silně závisí na použité referenční databázi. V současné době je pokrytí databází 16S/ITS mnohem lepší než celogenomových databází. Je to proto, že celé genomy mikrobů spojených s lidským mikrobiomem jsou mnohem lépe prozkoumány než genomy mikrobů spojených s jinými prostředími. Proto se doporučuje používat shotgun metagenomické sekvenování pro vzorky spojené s lidským mikrobiomem, jako jsou výkaly a sliny, pokud je hlavním cílem taxonomické profilování.
Metagenomické sekvenování je navíc více závislé na referenční databázi. Pokud například bakterie nemá v referenční databázi 16S žádného blízce příbuzného zástupce, můžete ji identifikovat na vyšším fylogenetickém stupni nebo jako neznámou bakterii. V případě shotgun metagenomického sekvenování však platí, že pokud bakterie nemá v referenční databázi genomu blízkého příbuzného (genom ze stejného rodu), pravděpodobně ji zcela přehlédnete. Například ZymoBIOMICS Spike-in Control I obsahuje dva mikroby cizí lidskému mikrobiomu (Imtechella halotolerans a Allobacillus halotolerans), jejichž genomy dříve nebyly k dispozici. Pokud je nasypete do vzorku stolice a sekvenujete pomocí shotgun sekvenování, většina bioinformatických pipeline je zcela vynechá, pokud tyto dva genomy ručně nepřidáte do referenční databáze. Na druhou stranu, pokud budou analyzovány pomocí sekvenování 16S, budou identifikovány díky přítomnosti jejich sekvence 16S v referenčních databázích.
False positives
Nástroje pro korekci chyb, jako je DADA2, nejen zlepšují taxonomické rozlišení sekvenování 16S/ITS, ale také zvyšují přesnost. To se ukazuje při sekvenování DNA z makety mikrobiálního společenství (např. ZymoBIOMICS Microbial Community Standard). Všechny sekvence 16S jsou obnoveny bez chyb v sekvenci, tj. bez falešně pozitivních výsledků. U shotgun metagenomického sekvenování však platí, že pokud v referenční databázi neexistuje dokonalý reprezentativní genom pro sekvenovaný mikrob, bioinformatická analýza pravděpodobně předpoví existenci více „blízce příbuzných“ genomů. Tyto blízce příbuzné genomy mohou pocházet z různých druhů téhož rodu nebo dokonce z různých rodů. Předpokládejme například, že existují tři blízce příbuzní mikrobi, A, B a C, a mají některé společné sekvence. Druh A sdílí některé sekvence pouze s druhem B a některé jiné sekvence pouze s druhem C. Pokud referenční databáze obsahuje pouze genomy z B a C, při sekvenování druhu A bioinformatika předpoví, že se v ní vyskytují jak B, tak C. Například A i B mohou být kmeny Escherichia coli a C je Salmonella enterica; sekvence jedinečně sdílené B a C mohou pocházet z horizontálního přenosu genů, který je běžný mezi blízce příbuznými mikroby. Z tohoto důvodu je sekvenování 16S/ITS lepší, pokud jde o falešně pozitivní výsledky.
Rušení hostitelskou DNA
Přítomnost příliš velkého množství hostitelské DNA může způsobit nespecifickou amplifikaci v procesu přípravy knihovny při sekvenování 16S a ITS, ale tento dopad lze kontrolovat úpravou cyklů PCR a změnou primerů. Na druhé straně je interference hostitelské DNA mnohem obtížnějším problémem pro shotgun metagenomické sekvenování, i když se náklady na sekvenování dramaticky snížily. V závislosti na typu vzorku mohou některé vzorky obsahovat >99 % lidské hostitelské DNA, což nejen zvyšuje náklady na sekvenování, ale také vnáší do měření nejistotu. Proto se mnoho výzkumníků před přípravou knihovny pro shotgun sekvenování zabývá deplecí hostitelské DNA, např. soupravou HostZERO Microbial DNA Kit. Po depleci hostitelské DNA, která obvykle vyžaduje minimální vstupní množství 1ng, však nemusí zůstat dostatek mikrobiální genomové DNA pro shotgun sekvenování. Interference hostitelské DNA je důvodem, proč se mělké shotgun sekvenování doporučuje pouze pro vzorky lidských fekálií.
Vstupní DNA
Zatímco shotgun metagenomické sekvenování vyžaduje minimálně 1 ng vstupní DNA, 16S/ITS sekvenování je mnohem citlivější, přičemž vstupní minima jsou femtogramy nebo dokonce pouhých 10 kopií genů 16S rRNA.
Pomůžeme vám
Výběr mezi sekvenováním 16S a shotgun metagenomickým sekvenováním je kritickým krokem pro všechny studie mikrobiomu. Kromě rozpočtu je třeba zvážit mnoho aspektů projektu, včetně typu vzorku, požadovaných analýz, taxonomického rozlišení a cílových organismů. Zohlednění těchto aspektů vám pomůže vybrat správnou metodu sekvenování pro váš příští mikrobiomový projekt. Služby sekvenování mikrobiomu společnosti ZymoBIOMICS nabízejí sekvenování 16S, ITS a shotgun jako kompletní služby od extrakce DNA přes sekvenování až po bioinformatiku. Odborníci na sekvenování a bioinformatiku ve společnosti Zymo Research vám rádi pomohou vybrat správnou metodu sekvenování pro vaši studii.
Zjistěte, která metoda sekvenování je pro vás nejlepší. Obraťte se na odborníky poskytující sekvenační služby ZymoBIOMICS.
Další informace
1. Laudadio I, Fulci V, Stronati L, Carissimi C. Metagenomika nové generace: Metodické výzvy a příležitosti. Omics a Journal of Integrative Biology 2019 23(7): 327-333.
2. Wood DE, Salzberg SL. Kraken: ultrarychlá klasifikace metagenomických sekvencí pomocí přesných zarovnání. Genome Biology 2014 15(3): R46.
3. Kim D, Song L, Breitwieser FP, Salzberg SL. Centrifuge: rychlá a citlivá klasifikace metagenomových sekvencí. Genome Research 2016 26(12): 1721-1729.
4. Segata N, Waldron L, Ballarini A, Narasimhan V, Jousson O, Huttenhower C. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods 2012 9(8): 811-814.
5. Sunagawa S, et al. Metagenomic species profiling using universal phylogenetic marker genes. Nature Methods 2013 10(12): 1196-1199.
6. Callahan BJ, McMurdie PJ, Rosen MJ, Han AW, Johnson AJA, Holmes SP. DADA2: Odvozování vzorků s vysokým rozlišením z amplikonových dat Illumina. Nature Methods 2016 13(7): 581-583.
7. Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, Reyes JA, Clemente JC, Burkepile DE, Vega Thurber RL, Knight R, Beiko RG, Huttenhower C. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology 2013 31(9): 814-821.
13. listopadu 2019