Analýza a popis stadií tvorby biofilmu Aspergillus fumigatus pomocí skenovací elektronové mikroskopie

Z lékařského hlediska je Aspergillus fumigatus oportunní patogen imunokompromitovaných osob, jehož závažnost onemocnění závisí na stavu imunity hostitele a vykazuje 50-95% mortalitu. Tato houba je příčinou lokálních infekcí, jako jsou dermatomykózy nehtů nebo plísňová keratitida, a invazivních infekcí, jako je aspergilóza, a představuje druhou nejčastější příčinu plísňových infekcí u hospitalizovaných pacientů. Infekce vyvolaná A. fumigatus v dýchacích cestách může způsobit plicní plísňovou kuličku, invazivní aspergilózu, invazivní plicní aspergilózu (IPA), hypersenzitivní pneumonitidu, astma, alergickou rýmu zprostředkovanou imunoglobulinem E, chronickou nekrotizující pneumonii nebo alergickou bronchopulmonální aspergilózu (ABPA). Kromě toho vyvolává osteomyelitidu a endokarditidu.

A. fumigatus vytváří biofilm, který může být jedním z nejdůležitějších faktorů virulence . Biofilm A. fumigatus vytváří mycelia zapuštěná do EMC in vitro a tvorba biofilmu byla popsána v lidských bronchiálních epiteliálních buňkách (HBE) a bronchiálních epiteliálních buňkách cystické fibrózy (CFBEC) a u pacientů s cystickou fibrózou . Tvorba plísňového biofilmu na katétrech a protézách přispívá ke vzniku nozokomiálních infekcí. K přetrvávání houbových infekcí tedy dochází díky schopnosti houby vytvářet biofilmy na nejrůznějších zdravotnických prostředcích a proto, že přetrvávající buňky představují důležitý mechanismus rezistence. Terapie, které je vystaven vytvořený biofilm v hostiteli, obvykle vyžaduje podávání toxických koncentrací antimikrobiálních látek a doporučená léčba zahrnuje odstranění kontaminovaného prostředku; to je však obtížný a nákladný proces. Houbové biofilmy proto představují závažný klinický a ekonomický problém .

V posledním desetiletí bylo publikováno několik studií o biofilmu A. fumigatus, a to jak in vivo (na myších modelech, u pacientů s invazivní plicní aspergilózou a na primárních lidských epiteliálních kulturách), tak in vitro (na polystyrenových destičkách). Obecně se tyto studie zabývají především stadiem zralosti biofilmu a chemickým složením ECM, přičemž jen málo z nich popisuje obrazy stadií biofilmu, ale kterákoli z nich popisuje všechna stadia tvorby biofilmu. Informace se tedy liší od příspěvků naší pracovní skupiny .

Nejdůležitější přínosy této studie jsou následující: i) poskytujeme popis každého stadia tvorby biofilmu A. fumigatus in vitro v průběhu času a tato stadia jsou doložena snímky SEM; ii) analyzovali jsme dva různé původy izolátů: jeden z prostředí a jeden od pacienta s rohovkovým vředem; iii) uvádíme mikrohyfy (klinický izolát) a houbové struktury, které byly doposud jen zřídka popsány a které podle našich znalostí nebyly u druhu Aspergillus popsány; a iv) poskytujeme popis disperzního kroku pro tvorbu kolonizace biofilmu na nových místech.

Pro analýzu strukturální organizace zralého biofilmu A. fumigatus (24hodinová inkubace při 28 °C a 37 °C) byly pomocí SEM zkoumány dva kmeny, jeden z půdy a druhý od pacienta s houbovou keratitidou. Z přehledu tvorby biofilmu A. fumigatus pozorovaného v tomto výzkumu vyplývá, že se tyto biofilmy chovaly podobně bez ohledu na to, zda se jednalo o izolát z půdy nebo z kliniky; rozdíly však představovaly podle inkubační teploty. Při teplotě 28 °C vykazoval biofilm podobné fáze, jaké jsou popsány u klasického mikrobiálního růstu: lag, exponenciální a stacionární fáze; růst biofilmu byl pomalý a stabilní s nízkou produkcí ECM a strukturní organizace houby byla jednoduchá (obr. 1). Při teplotě 37 °C vykazovala výkonnostní křivka poměrně variabilní lag (adaptační) a log (exponenciální) fázi, což by mohla být odpověď na stres způsobený inkubací při vysoké teplotě; při teplotě 37 °C tedy dochází ke zkrácení adaptační fáze (lag) za účelem udržení životaschopné houby; také log fáze s přerušovaným nárůstem a s oběma chováními je pravděpodobně adaptační odpovědí . Při 37 °C ve fázi zrání tedy docházelo k extrémně organizovaným strukturám mycelia, které bylo redukováno a zhutněno hyfami, které byly ztluštělé a srostlé do anastomózy, a ECM hojně pokrývala, obklopovala a zpevňovala houbové struktury (obr. 1). 3 a 4).

V této studii poskytujeme důkaz stádií biofilmu A. fumigatus pomocí SEM. Fáze pozorované během tvorby biofilmu byly následující:

Adherence, koagregace buněk a produkce EPS

V rané fázi (obr. 2/4 h) konidie adherují k povrchu desky prostřednictvím interakce elektrostatických sil mezi strukturními složkami buněčné stěny houby a tato přitažlivá síla je slabá, a proto reverzibilní. Nevratná a trvalá vazba byla široce popsána u specifických bakteriálních adhezinů přítomných na povrchu buněk, které se vážou na substrát a EPS, což jsou látky produkované mikroorganismem v počátečních fázích tvorby biofilmu, které fungují při adhezi buněk k sobě navzájem a k substrátu a jsou složeny z protein-sacharidových komplexů a glykoproteinů, které plní především strukturní nebo adhezivní funkce. Adheziny se podílejí na rozpoznávání bakteriálních buněk mezi sebou, včetně budování můstků a iniciace tvorby kolonií . Adheziny jsou popsány při adhezi hub při tvorbě biofilmu. U biofilmů Candida albicans, Candida glabrata a Candida tropicalis existuje skupina adhezivních genů podílejících se na tvorbě biofilmu, které patří do rodiny ALS (agglutinin-like sequence), jež hraje v tomto procesu klíčovou roli a kóduje proteiny mající vlastnosti adhezivních glykoproteinů na povrchu buněk. Rodina ALS přítomná u C. albicans zahrnuje osm genů (ALS1-ALS7 a ALS9), které kódují mnoho povrchových glykoproteinů . U A. fumigatus bylo na povrchu konidií identifikováno šest hydrofobinů zahrnujících tyčinky RodAp, RodBp, RodCp, RodDp, RodEp a RodFp. Tato hydrofobní vlastnost umožňuje adhezi k proteinům hostitelských buněk a mohly by se podílet na adhezi k povrchu polystyrenové desky a iniciovat proces tvorby biofilmu u všech nebo pouze u dvou či tří z nich . Dále Gravelat a spolupracovníci popsali tuto houbovou interakci a zjistili, že adhezin MedA řídí adherenci k polystyrenové desce, tvorbu biofilmu a expresi konidiačních genů a že má tvrdý vliv na proces konidiace u A. fumigatus . Adheze, která je výsledkem interakce mezi houbovými adheziny a povrchem destičky, a adheze konidium-konidium pravděpodobně spouští signalizaci a podporuje koagregaci buněk a produkci EPS a tyto děje jsou uvedeny na obr. 2 (4 h). EPS zároveň urychluje tvorbu houbových kolonií těsným spojením buněk (obr. 2 (8-12 h)) .

Klíčení konidií v hyfy a vývoj

Tvorba biofilmu vyžaduje prahový počet buněk, který umožní jejich detekci a vytvoření odpovědi, což je regulační mechanismus genové exprese se specifickými funkcemi . Při tvorbě biofilmu A. fumigatus je před zahájením klíčení konidií povrch konidií výrazně hydrofobní a je tvořen ze 40 % hydrofobními metylovými skupinami. Klíčení konidií A. fumigatus má za následek narušení hydrofobní bílkovinné vrstvy a odhalení vnitřních stěn konidií, které jsou v podstatě tvořeny polysacharidy, což jsou hydrofilní složky buněčné stěny. Na jedné klíčící spóře je hydrofobní špička. Konidium postupně ztrácí svou povrchovou hydrofobnost a poté nový růstový bod vykazuje koexistenci hydrofobních tyčinek a hydrofilních polysacharidů . Klíčení konidií v hyfy začíná tvorbou zárodečných trubic, jak je znázorněno na obr. 2 (8-12 h), které mají velmi hydrofilní charakter buněčné stěny a očekává se, že budou podporovat růst hyf .

Zrání biofilmu

A. fumigatus bylo pozorováno po 24 h, což je inkubační doba podobná těm, které uvádějí jiní výzkumníci. Mezi strukturní složky patří ECM, která je přítomna ve zralém biofilmu a váže buňky a vytváří strukturní základ biofilmu, včetně EPS a mnoha organizovaných mycelií (obr. 2 (24 h0) . ECM. Voda tvoří nejhojnější složku a v biofilmu tvoří téměř 97 %. V tomto vlhkém prostředí se nachází uspořádaná makromolekulární síť. Hlavní popsané funkce EPS v bakteriálních biofilmech jsou následující: adheze, agregace buněk, koheze; zadržování vody, ochranná bariéra jako specifická obrana hostitele nebo antimikrobiální látky, absorpce organických sloučenin a anorganických iontů, enzymatická aktivita, zdroj živin, výměna genetické informace, donor nebo akceptor elektronů, export buněčných složek, skladování přebytečné zadržované energie a stabilizace enzymů . U houbových biofilmů nejsou všechny tyto funkce zatím popsány, ale některé z nich se studují: kohezní a adhezní síly matrice přispívají k architektonické a mechanické stabilitě biofilmu. Houbové buňky jsou imobilizovány do matrice a fungují jako funkční ekosystém v neustále se měnících a homeostaticky regulovaných s intenzivními interakcemi, včetně komunikace mezi buňkami, která funguje jako lepidlo, jež drží buňky pohromadě . Struktura biofilmu se značně liší v závislosti na mikroorganismu, který jej vytváří, a okolních podmínkách jeho mikrohabitatů, včetně strukturálních rozdílů souvisejících s klinickým obrazem. Během infekčních procesů ECM podporuje ochranu před hostitelem i odolnost mikroorganismů vůči léčivům; ECM tedy není jen mechanickým rámcem, ale je také regulátorem chování buněk. Hydrofobní proteiny matrix se vážou se specifickými receptory na povrchu buněk, což vede k adhezi buňky k matrix, která má vliv na tvar, migraci, proliferaci, přežívání a metabolismus buněk. Kromě toho ECM chrání buňky před inzulty prostředí, včetně vysychání, ultrafialového záření (UV), radiace, oxidace, hladovění, působení predátorů a imunitní obrany hostitele a antibiotik . Charakteristiky ECM byly patrné na obr. 2 (24 h) a obr. 3 a přiléhaly k houbovým hyfám do přilehlého pláště a byly rovněž pozorovány s porézní konzistencí (obr. 2 (24 h)). V biofilmu A. fumigatus byl EPS vysoce strukturně uspořádaný a měl hojnou produkci, která pokrývala, obklopovala a zpevňovala houbové struktury; působí jako kohezivum pro splynutí struktur hyf a hyf (pouze 37 °C). EPS se vyskytuje se slizovitým vzhledem, který zcela přilne a pokryje hyfy, způsobí anastomózu a uzavře lumen vodních kanálků (obr. 2 (24 h), 3 a 4). V předchozích studiích naše pracovní skupina popsala stadium zrání biofilmu A. fumigatus, ve kterém byly pozorovány podobné struktury .

U některých mikrokonzort je chemické složení EPS známo (mimo jiné sacharidové polymery, DNA a/nebo proteiny a, lipidy), ale jiné dosud nebyly identifikovány. A. fumigatus‘-povrch se skládá z α-1,3-glukanů, chitinu, chitosanu, galaktomananu, galaktosaminogalaktanu, melaninu a proteinů. Složení a strukturální uspořádání buněčné stěny se neustále mění; i když jsou přítomné polysacharidy stejné, jejich množství a lokalizace se mění v závislosti na růstových podmínkách a nutričním prostředí. Zde jsme ukázali chemické složení biofilmu A. fumigatus, které bylo pozorováno na základě kolokace fluorochromů navázaných na chitin, metabolické aktivity a nukleových kyselin pomocí CLSM; navíc bylo pozorováno překrývání signálů fluorochromů, pokud byly navázány dva nebo tři z nich (obr. 5). Funkce popsaná u polysacharidů, jako jsou α 1,3-glukany, spočívala v jejich převažující úloze in vitro při agregaci hyf a při agregaci hyf v biofilmech. Je známo, že další polysacharidy ECM, včetně galaktomannanu a galaktosaminogalaktanu, mají rovněž úlohu při ochraně houby a při adhezi jejích biofilmových struktur k povrchům . Extracelulární DNA (eDNA) je důležitou složkou ECM biofilmu, která udržuje strukturální a architektonickou integritu A. fumigatus. eDNA vzniká autolýzou a je významně spojena s úrovní antimykotické rezistence (obr. 5). Kromě toho může být eDNA rezervoárem genů pro horizontální přenos genů. DNA propůjčuje pevnější a odolnější strukturní uspořádání, pokud je kolokalizována s polysacharidy. eDNA pochází z houbových buněk díky sekreci chitináz A. fumigatus, která upřednostňuje její uvolňování (obr. 5) . V biofilmu má modifikace buněčné stěny zásadní vliv na rezistenci vůči léčivům z buněčné stěny. U A. fumigatus byl na modelu myšího biofilmu u multirezistentních (MDR) efluxních pump AfuMDR4 gen spojený s výdejem antimikrobiálních látek významně indukován ošetřením vorikonazolem po 24 h . Marker FUN1 odhalil metabolickou aktivitu, která je živým společenstvím (obr. 5).

Mycelia: Biofilm vykazuje složitou trojrozměrnou (3-D) strukturu, která odráží koordinovaný buněčný proces; byl patrný vývoj a expanze mycelia, která zahrnovala kompaktní sítě hyfového vrstvení, adhezi hyf, anastomózu při obou teplotách, s optimálním prostorovým uspořádáním – vytvořenými kanály, které zajišťují přítok živin a odtok odpadních produktů, a tím stabilizují biofilm; při 37 °C byl tento kanál více patrný (obr. 2 (24 h), 3 a 4). Kromě toho byly tyto struktury pozorovány i dalšími výzkumníky . Mikrohyfy: V raných fázích zrání biofilmu byly u klinického izolátu pozorovány nepravidelné houbové struktury, jako jsou mikrohyfy (obr. 4). Tato skutečnost je důležitá, protože v literatuře je málo zmínek o mikrohyfách a toto je poprvé, kdy byly popsány u A. fumigatus. Mikrohyfy vykazují změny cytoskeletu, které vytvářejí krátké a štíhlé hyfy s tenkými stěnami a s ohnutými konci. Mikrohyfy jsou spojeny s vysokou enzymatickou aktivitou, která podporuje proces zrání a následnou disperzi buněk ve stadiu biofilmu .

Disperze buněk

Během disperze buněk se část biofilmu oddělí, přičemž část tvoří konidie nebo hyfy. Byl pozorován asynchronní vývoj biofilmu, zejména ve fázi zrání biofilmu, kdy byly nové konidie schopny klíčit, vytvářet nový myceliální růst a modifikace hyf, jako jsou kudrlinky (obr. 4 a 6). K disperzi buněk biofilmu dochází v reakci na změny prostředí. Ta působí na odstranění nebezpečné látky z hlavního těla biofilmu. Tento proces vede k diseminaci a šíření indoktrinovaných buněk biofilmu na novém místě, což je podporováno složitými molekulárními ději . Biofilmy lze považovat za ochranné obaly živých buněk pod nimi, které mají extrémně složité a nesčetné funkce, a jedná se tedy o skutečně pozoruhodné biologické konstrukce. Biofilmy poskytují ochranu před predací nebo chemickým útokem a poskytují vnitřním buňkám prostředí pro vnitrobuněčnou komunikaci, tok živin a přenos genetického materiálu. Disperze buněk šíří životaschopné buňky na další místa v prostředí nebo uvnitř hostitele, kde se mohou rozmnožovat, a tím usnadňuje jejich přetrvávání. K disperzi buněk dochází v důsledku nedostatku živin v prostředí, a jedná se tedy o mechanismus přežití. Disperze buněk je proto důležitá nejen pro podporu genetické rozmanitosti, ale také pro únik z nepříznivého prostředí, což napomáhá rozvoji nových nik a přetrvávání mikroorganismu na novém místě .

.