Anatomie a fyziologie

Mikroskopie je technický obor, který se zabývá používáním mikroskopů (zvětšovacích přístrojů) k prohlížení objektů a oblastí objektů, které nelze vidět pouhým okem (objekty, které nejsou v rozlišovacím rozsahu normálního oka).17 Mikroskop je zařízení, které používá čočku nebo soustavu čoček k vytvoření značně zvětšeného obrazu objektu. Moderní mikroskopie dnes k pořizování a analýze snímků používá softwary, jako jsou ImageJ, CellProfiler, NeuronStodio.1

Existují dvě odvětví mikroskopie.1,18

1. Světelný mikroskop (jednoduchý, složený mikroskop, pitevní mikroskop (stereomikroskop), srovnávací mikroskop, inverzní mikroskop, chirurgický a digitální mikroskop.
2. Elektronový mikroskop (transmisní a skenovací elektronový mikroskop)

Světelný mikroskop

Tento mikroskop se také označuje jako optický mikroskop, je typ mikroskopu, který využívá viditelné světlo a soustavu čoček ke zvětšení obrazu malých vzorků.17 Optické mikroskopy jsou nejstarší konstrukcí mikroskopu a v současné složené podobě byly pravděpodobně vynalezeny v 17. století. Základní optické mikroskopy mohou být velmi jednoduché, ačkoli existuje mnoho složitých konstrukcí, jejichž cílem je zlepšit rozlišení a kontrast vzorku, jako jsou složené, pitevní a chirurgické mikroskopy.19 Moderní mikroskopy umožňují více než jen pozorování obrazu vzorku v procházejícím světle; existuje mnoho technik, které lze použít k získání dalších druhů údajů. Většina z nich vyžaduje kromě základního složeného mikroskopu další vybavení.17 Optická mikroskopie se hojně využívá v histologii, histopatologii, mikroelektronice, nanofyzice, biotechnologiích, farmaceutickém výzkumu, mineralogii a mikrobiologii.20

Prostý mikroskop: Jednoduchý mikroskop používá čočku nebo soustavu čoček ke zvětšení objektu pouze úhlovým zvětšením, takže pozorovatel získá vzpřímený zvětšený virtuální obraz.21 Použití jediné vypouklé čočky nebo skupiny čoček se stále vyskytuje v jednoduchých zvětšovacích zařízeních, jako jsou lupy, lupy a okuláry pro dalekohledy a mikroskopy.22

Složený mikroskop: Složený mikroskop používá čočky (objektivy) v blízkosti pozorovaného předmětu ke sběru světla, které zaostří skutečný obraz předmětu uvnitř mikroskopu. Tento obraz je pak zvětšen druhou čočkou nebo skupinou čoček (nazývanou okulár), která poskytuje pozorovateli zvětšený invertovaný virtuální obraz objektu.18 Použití kombinace složeného objektivu a okuláru umožňuje mnohem větší zvětšení (až 1000-2000krát) (obrázek 7). Složený mikroskop také umožňuje pokročilejší nastavení osvětlení, například fázový kontrast.21,22

Složený mikroskop: Stereomikroskop je mikroskop s malým výkonem, který poskytuje stereoskopický pohled na vzorek (až 100násobné zvětšení), běžně se používá k pitvě (obrázek 8).18

Invertovaný mikroskop: pro studium vzorků zespodu; užitečný pro buněčné kultury v kapalině nebo pro metalografii (Obrázek 9).18

Srovnávací mikroskop: Jedná se o zařízení, které se používá k analýze vzorků vedle sebe. Skládá se ze dvou mikroskopů spojených optickým můstkem, jehož výsledkem je rozdělené pozorovací okénko umožňující současné pozorování dvou samostatných objektů. Má dvě oddělené světelné cesty, které umožňují přímé porovnání dvou vzorků prostřednictvím jednoho obrazu v každém oku (obrázek 10). Pozorovatel se tak nemusí spoléhat na paměť při porovnávání dvou objektů pod běžným mikroskopem.27

Digitální mikroskop: Jedná se o variantu tradičního optického mikroskopu, která využívá optiku a digitální kameru k výstupu obrazu na monitor, někdy pomocí softwaru spuštěného na počítači.20 Digitální mikroskop má často vlastní vestavěný LED zdroj světla a od optického mikroskopu se liší tím, že nemá možnost pozorovat vzorek přímo okulárem. Vzhledem k tomu, že obraz je zaměřen na digitální obvod, je celý systém určen pro obraz na monitoru (obrázek 11). Okulár pro lidské oko je vynechán.20

Chirurgický mikroskop: Používají se ke zvýšení zvětšení chirurga (až 4-40krát) při chirurgických zákrocích.29 Původně se používaly pro ušní, nosní a krční chirurgii. Stále však stanovují nové standardy ve všeobecné chirurgii, oftalmologii, ortopedické chirurgii, gynekologické chirurgii, otolaryngologii, neurochirurgii, ústní a čelistní chirurgii, plastické chirurgii, podiatrické chirurgii a dětské chirurgii (obr. 6).29

Elektronový mikroskop

Celková konstrukce elektronového mikroskopu je podobná konstrukci světelného mikroskopu. Světlo jsou nahrazeny elektrony, skleněné čočky jsou nahrazeny elektromagnetickými a elektrostatickými čočkami. Elektronové mikroskopy mají systémy elektronových optických čoček, které jsou analogické skleněným čočkám optického světelného mikroskopu, existují dva hlavní typy elektronových mikroskopů: transmisní elektronový mikroskop (TEM) a skenovací elektronový mikroskop (SEM), z nichž TEM je nejčastěji používaný (obrázek 12).22 Největší výhodou je, že mají vyšší rozlišení než světelný mikroskop, a proto jsou také schopny většího zvětšení (až 2 milionkrát).31 Elektronové mikroskopy umožňují vizualizaci struktur, které by za normálních okolností nebyly optickou mikroskopií viditelné.32 Elektronové mikroskopy se používají ke zkoumání ultrastruktury široké škály biologických a anorganických vzorků včetně mikroorganismů, buněk, velkých molekul, bioptických vzorků, kovů a krystalů (obr. 13).31 Moderní elektronové mikroskopy vytvářejí elektronové mikrofotografie pomocí specializovaných digitálních kamer a frame grabberů, které zachycují obraz.

Přenosový elektronový mikroskop (TEM)

Přenosová elektronová mikroskopie je technika vyvinutá k získání zvětšení, a tedy i detailů vzorku, na mnohem lepší úrovni než konvenční optické mikroskopy.34,35 Při TEM prochází ultratenkým vzorkem svazek elektronů, který při průchodu vzorkem interaguje. Z interakce elektronů procházejících vzorkem vzniká obraz, který je zvětšen a zaostřen na zobrazovací zařízení, jako je fluorescenční stínítko, na vrstvu fotografického filmu nebo je detekován snímačem, jako je CCD kamera.2 V TEM elektrony pronikají tenkým vzorkem a poté jsou zobrazovány vhodnými čočkami v široké analogii s biologickým světelným mikroskopem.22 TEM se skládá z osvětlovacího systému, stolku vzorku, zobrazovacího systému a vakuového systému. Transmisní elektronová mikroskopie je významnou analytickou metodou ve fyzikálních, chemických a biologických vědách. TEM nachází uplatnění ve výzkumu rakoviny, virologii a materiálových vědách, stejně jako ve výzkumu znečištění, nanotechnologií a polovodičů.36

Skenovací elektronový mikroskop (SEM)

Skenovací elektronový mikroskop, má podobnou strukturu jako TEM, ale sloupec je podstatně kratší, protože jediné potřebné čočky jsou ty nad vzorkem, které se používají k zaostření elektronů do jemného bodu na povrchu vzorku.37 Pod vzorkem nejsou žádné čočky. Na druhou stranu je komora pro vzorek větší, protože technika SEM neklade žádné jiné omezení na velikost vzorku než to, které je dáno velikostí komory pro vzorek.38 SEM vytváří obrazy vzorku skenováním povrchu fokusovaným svazkem elektronů. Elektrony interagují s atomy ve vzorku a vytvářejí různé signály, které obsahují informace o topografii a složení povrchu vzorku.39 Svazek elektronů se skenuje v rastrovém obrazci a poloha svazku se kombinuje se zjištěným signálem, čímž vzniká obraz. SEM může dosáhnout rozlišení lepšího než 1 nanometr.40

Ultrasonografie

Ultrasonografie se také označuje jako dopplerovská studie nebo ultrazvukové vyšetření používané pro lékařskou diagnostiku, je to bezbolestná a neinvazivní technika, která využívá ultrazvukový přístroj s tichými vysokofrekvenčními zvukovými vlnami (1 až 5 megahertzů) k vytvoření živých obrazů vnitřních struktur těla známých také jako sonogram. Umožňuje lékařům zobrazit nemocné nebo normální orgány či tkáně (např. močový měchýř, dělohu, ledviny a vaječníky) uvnitř těla bez provedení řezu. Ultrazvukové vyšetření je doporučenou lékařskou technikou pro zobrazení plodu u těhotných žen/zvířat, protože neprodukuje záření jako jiné lékařské zobrazovací techniky.2

Ultrazvuková technika zahrnuje použití tekutého gelu a ruční sondy s převodníkem na povrchu těla. Sonda, která obsahuje akustický měnič, vysílá a přijímá miliony pulzů a ozvěn do těla za sekundu. Zvukové vlny pronikají do těla a narážejí na hranici mezi tkáněmi (např. měkkou tkání a kostí), vlny se odrážejí zpět do sondy snímače a poté se přenášejí do centrální výpočetní jednotky (CPU) (obrázek 14-16). CPU je stroj, který dodává elektrickou energii snímači, vypočítává dobu odrazu vlny a hloubku rozhraní tkání, které vlnu způsobují, aby se na monitoru vytvořil dvojrozměrný obraz. Procedura obvykle trvá minimálně 30 minut.41,42

Níže jsou uvedeny různé typy ultrazvukového

2D ultrazvukového obrazu: Jedná se o nejběžnější typ ultrazvukového obrazu, jedná se o sérii plochých, dvourozměrných snímků průřezu snímané tkáně. Tento způsob snímání je po půlstoletí používání stále standardem pro mnoho diagnostických a porodnických situací.43-46

3D ultrazvukový obraz: Jedná se o trojrozměrný obraz (3D), který se získává z příčných řezů tkání snímaných pod několika úhly a získaná data se rekonstruují do trojrozměrného obrazu. Tento ultrazvuk se běžně používá k získání úplnějšího a realističtějšího sonogramu (obrazu) plodu a při diagnostice rozštěpu rtu.44-47

4D ultrazvukový obraz: využívá zvukové vlny k vytvoření živého obrazu plodu v děloze.43-46 3D a 4D ultrazvuk vytváří realistický obraz pohybujícího se nebo vyvíjejícího se plodu v děloze, který nelze snadno vidět na 2D ultrazvukovém snímku.43-46

Dopplerovský ultrazvukový obraz: Tato technika zahrnuje použití odražených zvukových vln k odhalení vzoru a způsobu proudění krve v cévách, což nelze vidět na 2D, 3D a 4D ultrazvukovém obraze. Dopplerovský ultrazvuk lze využít při diagnostice několika abnormalit srdce a cév, jako je žilní nedostatečnost, stenózy tepen, krevní sraženiny, aneuryzmata a vrozená onemocnění srdce. Při dopplerovském ultrazvuku se snímač pohybuje po kůži podél cév a vysílá a odráží zvukové vlny, vysokofrekvenční zvukové vlny se odrážejí od cirkulujících krevních buněk, což zpětně mění frekvenci odražených vln, označovanou jako dopplerovský efekt, a v případě nepřítomnosti krevního toku nedochází ke změnám v odražených zvukových vlnách. Údaje z odražených zvukových vln s Dopplerovým efektem se používají ke konstrukci grafu znázorňujícího vzor a způsob průtoku krve cévami na CPU. Existují tři typy dopplerovského ultrazvuku, a to: barevný doppler, spektrální doppler a výkonový doppler.43-46

Barevný doppler: Tento typ ultrazvuku využívá tradiční 2D ultrazvuk k vytvoření obrazu cévy a pomocí počítače mění dopplerovské zvukové vlny na barvy, které na obraze cévy představují směr a rychlost toku krve.43-46

Power doppler: Jedná se o citlivější typ barevného dopplera, který se používá k vytvoření detailů krevního toku v pevném orgánu, které nelze zobrazit pomocí běžného barevného dopplera. Pomocí výkonové dopplerovské ultrasonografie však nelze zobrazit směr toku krve. 43-46

Spektrální doppler: Jedná se o typ ultrazvuku, který využívá grafické znázornění toku a směru krve. Dokáže zobrazit stupeň ucpání cévy.43,45

Kontinuální vlnový doppler: Tento ultrazvuk využívá zvukové vlny, které jsou vysílány a odráženy kontinuálně. Tento typ zvukových vln se používá k detekci ucpání cév a k přesnému měření rychle proudící krve.43-46

Radiografie

Jedná se o nejstarší a nejběžnější diagnostickou zobrazovací techniku.3 Je to neinvazivní technika jako ultrasonografie, využívá však velmi malé množství ionizujícího nebo neionizujícího záření (rentgenových paprsků) generovaného rentgenovým přístrojem k vytvoření skrytého obrazu vnitřních struktur těla na rentgenovém filmu (projekční radiografie). Rentgenový přístroj může být pevný, mobilní nebo přenosný (Obrázek 17-19).48-51 Během radiografie je rentgenové záření nasměrováno na tělo, což mu umožňuje projít cílovým orgánem a poté je zachyceno za plochým rentgenovým filmem, čímž vznikne 2D obraz (Obrázek 20). Rentgenové vyšetření může být provedeno s kontrastní látkou nebo bez ní (např. baryum nebo jód) v závislosti na hustotě vyšetřovaného orgánu. Rentgenové vyšetření lze použít při diagnostice několika stavů, jako jsou zlomeniny kostí a rakovina, nádor prsu a tuberkulóza.48 S nadměrnou expozicí rentgenovému záření jsou spojena určitá rizika, jako je rakovina, vypadávání vlasů a popáleniny kůže. Ve většině případů však přínosy převažují nad riziky.3,52

Počítačová tomografie (CT)

Počítačová tomografie je druh radiografie, který rovněž využívá rentgenové záření, na rozdíl od projekční radiografie využívá CT větší množství rentgenového záření a poskytuje detailnější 3D obraz, nicméně v posledních letech byly některé CT vyvinuty tak, aby využívaly menší množství rentgenového záření. CT přístroj se skládá z CT skeneru ve tvaru koblihy, stolu, rentgenové trubice, detektoru rentgenového záření a počítače (obr. 21).54,55 Pacient leží na stole a poté se posunuje do CT skeneru, rentgenová trubice a kamera se pohybují kolem pacienta v úhlu 360° a snímají a vytvářejí vícenásobný obraz vnitřních orgánů těla, v závislosti na orgánu zájmu může být podána kontrastní látka buď ústy, konečníkem nebo vstříknuta do žíly, aby se zvýraznil snímaný orgán.55 Skenování se provádí v oddělené počítačové místnosti, kde se snímky zobrazují a technolog komunikuje s pacientem pomocí reproduktorů a mikrofonů.56 Hlavní výhodou CT vyšetření je rychlé získání jasnějších diagnostických snímků větší části těla.56,57

Existují specializované veterinární CT skenery, jako je například dobíjecí veterinární CT skener, tento skener je vybaven rentgenovou skříní, která umožňuje veterinárnímu lékaři zůstat během skenování v blízkosti zvířete, protože tak není nutná samostatná místnost jako při běžném CT skenování u lidí (obr. 22).57 Během skenování bude zvíře anestetizováno a monitorováno, před zasunutím do CT skeneru bude umístěno a podepřeno na pojízdném stole (obrázek 23).60,61

Magnetická rezonance (MRI)

Magnetická rezonance (MRI) je bezbolestná, neinvazivní diagnostická zobrazovací technika, která využívá silné magnetické pole a rádiové vlny k vytvoření 3D obrazu vnitřních orgánů těla. Při MRI nedochází k ozařování jako při radiografii (projekční radiografie, CT a PET).4 Přístroj MRI vypadá podobně jako CT a PET, i když tato technika trvá déle a vydává větší hluk (obrázek 24).5,61,63

Při skenování pacient (s kontrastní látkou nebo bez ní) leží na stole, který se zasune do trubice obsahující velký magnet, jenž kolem těla pacienta vytváří magnetické pole a rádiové vlny, které umožňují vibrace tkání těla. Tyto vibrace jsou v počítači převedeny na detailní obraz (obrázek 25).5

Pozitronová emisní tomografie (PET)

PET je 3D funkční zobrazovací technika, Na rozdíl od CT a rentgenu prokazuje fyziologické aktivity tkání a orgánů těla pomocí radiotraceru (18F-FDG). Způsob podání radiotraceru (perorální, žilní nebo nosní) závisí na tkáni nebo orgánu zájmu.64 Vstříknutý radiotracer se koncentruje ve tkáni, která je zobrazena na počítači jako 3D obraz. Přístroj je podobný CT a MRI a moderní snímky PET lze kombinovat se snímky CT nebo MRI a vytvořit tak jedinečné zobrazení (obr. 26).66

Snímky PET se používají především při studiu a diagnostice nádorů a poruch spojených s mozkem a srdcem. Tato technika je také bezbolestná a neinvazivní, nicméně se nedoporučuje těhotným ženám, kojícím matkám kvůli záření, které vyzařuje radiotracer 18F-fluoro-2-deoxyglukóza (18F-FDG) (tabulka 1). Obraz PET je barevný snímek, který zobrazuje nejaktivnější oblasti orgánu nebo tkáně v závislosti na množství absorbovaného radiotraceru (obrázek 27).5,68-70

.