Antisense Oligonucleotides Targeted to SMN2
ASO jsou jednořetězcové nukleové kyseliny syntetizované jako komplementární k cílové sekvenci RNA. Po podání se ASO dostává do buňky dosud nedostatečně definovaným endocytickým mechanismem a poté vstupuje do jádra, kde se váže na cílovou pre-mRNA.62 Zpočátku se ASO používaly k potlačení genové exprese buď zablokováním translace cílové RNA, nebo podporou její degradace. V současné době mohou být ASO navrženy také tak, aby měnily zpracování nebo sestřih cílové RNA. Terapeutické ASO pro SMA jsou navrženy tak, aby modifikovaly alterativní sestřih pre-mRNA SMN2 tak, aby do konečného zpracovaného transkriptu byl zahrnut exon 7. Jak bylo uvedeno v předchozích kapitolách, SMN2 se od SMN1 liší přechodem C-T, který se vyskytuje šest nukleotidů v exonu 7 (mezi oběma sekvencemi jsou i další rozdíly, ale tento je funkčně nejdůležitější). Přechod C-T vytváří v exonu 7 rozšířený inhibiční kontext (známý také jako „Exinct“).63 Protože exon 7 je jinak slabě definován díky slabému 5′-splicingovému místu, mutace C-T v SMN2 stačí k tomu, aby vychýlila rovnováhu od jeho zařazení k vyloučení.
Splicingové regulační elementy hrají důležitou roli při určování, která místa jsou rozpoznávána buněčným splicingovým strojem. Umístění a funkce příslušných prvků SMN2 byly identifikovány analýzou sestřihového účinku rozsáhlé série ASO navržených tak, aby postupně iterativním způsobem doplňovaly sekvenci SMN2.63-66 Intronický tlumič sestřihu ISS-N1 byl touto metodou identifikován jako velmi silný tlumicí prvek; motiv se nachází za místem 5′ sestřihu exonu 7 a váže se na tlumič sestřihu hnRNP A1.66-68 ASO byly navrženy tak, aby spolehlivě indukovaly zařazení exonu 7 zacílením na ISS-N1 nebo jiné regulační prvky.
ASO mohou být navrženy jako bifunkční. Například bylo prokázáno, že chimérické ASO, které spojují SR náborovou doménu (RS peptid) s antisense sekvencí, která potlačuje silencerové motivy, zvyšují inkluzi exonu 7 a hladiny proteinu SMN v pacientských fibroblastech; jediná injekce bifunkčního ASO dokázala indukovat protein SMN v mozku neonatálních myší a vedla k prodloužení délky života.65,69 Tato strategie návrhu ASO, známá jako ESSENCE (exon-specific splicing enhancement by small chimeric effectors), byla původně sledována v terapii SMA, ale pozdější studie ukázaly, že peptid RS není nezbytný k dosažení silného účinku na inkluzi exonu 7 SMN2. Vzhledem k tomu, že chimérický přístup přináší obtíže při výrobě ASO a omezuje buněčnou prostupnost ASO, nebyly bifunkční ASO rozsáhle testovány na myších a v současné době se klinicky nevyvíjejí.62
Když se ukázalo, že ASO zaměřené na ISS-N1 jsou pozoruhodně účinné při podpoře inkluze exonu 7, další strategickou otázkou bylo určit, která páteř ASO by byla nejlépe využitelná v potenciální terapii SMA. Oligonukleotidy tvořící ASO jsou obvykle upraveny tak, aby optimalizovaly farmaceutické vlastnosti, jako je buněčná absorpce, toxikologie, farmakokinetika a vazba na cíl. Běžná úprava, která vzešla ze spolupráce mezi společností Ciba-Geigy Ltd. (nyní známá jako Novartis) a Isis Pharmaceuticals (nyní známá jako Ionis Pharmaceuticals), je 2′-O-methoxyethyl (2′-MOE), který zvyšuje odolnost ASO vůči degradaci nukleázami i hybridizační afinitu.70 Bylo prokázáno, že 2′-MOE oligonukleotidy jsou velmi bezpečné u hlodavců a primátů, včetně lidí.62 Podávání 2′-MOE ASO blokujícího ISS-N1 úspěšně zvýšilo exon 7 SMN2 v závislosti na dávce a čase u myší s SMA, což zlepšilo neuromuskulární patologii a výrazně prodloužilo přežití.68,71,72 Společnost Ionis Pharmaceuticals ve spolupráci s Biogenem vyvíjí terapii 2′-MOE ASO nazvanou nusinersen (známý také jako IONIS-SMNRx a dříve nazývaný ISIS-SMNRx). Předklinické studie nusinersenu na nehumánních primátech ukázaly, že jediná intratekální injekce může vést k dosažení tkáňových koncentrací nezbytných pro významné zlepšení začlenění exonu 7 a tyto koncentrace se udržují po dobu několika měsíců.62 Dlouhý poločas rozpadu léku znamená, že pacienti mohou potřebovat intratekální injekci pouze jednou za několik měsíců.73 V otevřené studii fáze 1 u pacientů se SMA typu II/III ve věku 2-14 let byla jediná injekce nusinersenu dobře snášena a zdá se, že při nejvyšším dávkování korelovala se zvýšením skóre HFMSE.74 V červnu 2015 společnost Ionis zveřejnila nová data z probíhající otevřené studie fáze 2 s nusinersenem u kojenců typu I, která ukázala, že kojenci žili déle a dosáhli více motorických milníků, než by se normálně očekávalo na základě přirozeného průběhu onemocnění.75 Mechanismus účinku léku byl navíc podpořen údaji, které ukázaly zvýšení množství mRNA SMN2 plné délky a proteinu SMN v mozkových a míšních tkáních z pitev pacientů, kteří byli léčeni. Společnost Ionis také zveřejnila údaje ze své otevřené studie fáze 2 s prodloužením u dětí s SMA typu II/III, které ukázaly, že 57 % subjektů dosáhlo alespoň tříbodového zlepšení v testu HFMSE a průměrného zlepšení o 55 m v testu 6minutové chůze (6MWT).76 V současné době probíhají studie fáze 3 nusinersenu u dětí i dospělých se SMA (NCT02193074; NCT02292537); výsledky by měly být k dispozici v roce 2017.
Ačkoli při použití 2′-MOE v terapii SMA nebyly dosud pozorovány žádné bezpečnostní problémy, u jiných populací pacientů byly s 2′-MOE ASO spojeny některé toxické účinky.77,78 Další modifikací páteře, která se zkoumá pro použití u SMA a která může tyto problémy obejít, jsou fosforoamidátové morfolinové oligomery (PMO). Ukázalo se, že PMO jsou účinnější než 2′-MOE u myších modelů Duchennovy svalové dystrofie (DMD), dalšího dětského nervosvalového onemocnění, a byly také dobře snášeny pacienty s DMD.79 ICV injekce morfolinových ASO doplňujících ISS-N1 významně zlepšila přežití myší s SMA bez známek toxicity pro centrální nervový systém (CNS).80,81 Morfolino cílené na ISS-E1, intronický sestřihový tlumič nacházející se před exonem 7, rovněž zlepšuje fenotyp myší s SMA.82 Tento přístup zatím nebyl zaveden do klinické praxe.
Chemická podstata ASO může ovlivnit vhodnost pro různé metody podání, nutnost opakovaného dávkování a související toxicitu – to vše má důležité důsledky pro jeho terapeutické použití. ASO používaný k léčbě SMA musí navíc zůstat farmakologicky aktivní v tkáních CNS, zejména v motorických neuronech. Bez ohledu na páteř bude muset být jakýkoli ASO určený pro léčbu SMA pravděpodobně podáván přímo do mozkomíšního moku prostřednictvím intratekální injekce. Ačkoli některé studie využívající periferní podání ASO u neonatálních myší prokázaly účinnost, hematoencefalická bariéra není u mladých myší plně vytvořena a periferně podaný ASO je schopen proniknout do CNS v míře, která není možná u lidí.71 Povzbudivé je, že ASO podané intratekálně se široce distribuují mezi důležité tkáně CNS, jako jsou motorické neurony, astrocyty a mikroglie.72,83-85
Ačkoli je intratekální injekce poněkud invazivní a vyžaduje sedaci nebo anestezii, ASO mají oproti jiným experimentálním modalitám několik významných výhod, včetně vysoké cílové specifičnosti, pozoruhodné účinnosti, malé toxicity ve srovnání se systémovým podáním ASO a relativně jednoduchých výrobních postupů ve srovnání s biologickými látkami (nikoli však malými molekulami). Více informací naleznete v kapitole 18.
.