Požadavky na vzorky a postup
ELISA se provádí v polystyrenových destičkách, obvykle v 96jamkových destičkách potažených tak, aby velmi silně vázaly protein. V závislosti na typu testu ELISA vyžaduje testování primární a/nebo sekundární detekční protilátku, analyt/antigen, potahovou protilátku/antigen, pufr, promývací prostředek a substrát/chromogen. Primární detekční protilátka je specifická protilátka, která se váže pouze na protein zájmu, zatímco sekundární detekční protilátka je druhá protilátka konjugovaná s enzymem, která váže primární protilátku, která není konjugovaná s enzymem.
Při provádění imunoanalýzy ELISA existují čtyři hlavní obecné kroky. Tyto kroky jsou následující:
-
Potažení (buď antigenem, nebo protilátkou)
-
Blokování (obvykle přídavkem hovězího sérového albuminu )
-
Detekce
-
Finální čtení
.
Detekce se provádí přidáním substrátu, který může generovat barvu. Pro použití v detekci ELISA je k dispozici mnoho substrátů. Nejčastěji se však používá křenová peroxidáza (HRP) a alkalická fosfatáza (ALP). Substrátem pro HRP je peroxid vodíku a vede ke změně barvy na modrou. ALP měří žluté zbarvení nitrofenolu po inkubaci při pokojové teplotě trvající 15 až 30 minut a jako substrát obvykle používá P-nitrofenyl-fosfát (pNPP).
Mezi každým z výše uvedených čtyř kroků je „promytí“ destičky pomocí pufru, jako je fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) a neiontový detergent, k odstranění nenavázaného materiálu. Jamky se během každého promývacího kroku promyjí dvakrát nebo vícekrát, v závislosti na konkrétním protokolu, který se používá.
V protokolu ELISA se obvykle do jamek destičky umístí sériové ředění koncentrací. Po změření výsledků se z údajů sériových ředění vynese standardní křivka s koncentrací na ose x pomocí logaritmické stupnice a absorbancí na ose y pomocí lineární stupnice.
Existují čtyři hlavní typy ELISA:
-
Přímá ELISA (destička potažená antigenem; screening protilátky)
-
Přímá ELISA (destička potažená antigenem; screening antigenu/protilátky)
-
Sandvičová ELISA (destička potažená protilátkou; screening antigenu)
-
Kompetitivní ELISA (screening protilátky)
Přímá ELISA
Přímá i nepřímá ELISA začínají nanesením antigenu na ELISA destičky. První krok vazby zahrnuje přidání antigenu na destičky, které se inkubují jednu hodinu při 37 °C nebo mohou být inkubovány při 4 °C přes noc. Po dokončení inkubace je dalším krokem promytí destiček od případných nenavázaných protilátek a zablokování nenavázaných míst na destičce ELISA pomocí látek, jako je BSA, ovalbumin, aprotinin nebo jiné živočišné bílkoviny. Tento druhý krok je důležitý, protože zabraňuje vazbě jakýchkoli nespecifických protilátek na destičku a minimalizuje falešně pozitivní výsledky. Po přidání pufru se destička znovu promyje a přidá se vybraná primární detekční protilátka konjugovaná s enzymem. Destička se dále inkubuje po dobu jedné hodiny.
Při přímé ELISA se primární detekční protilátka váže přímo na protein zájmu. Poté se destička znovu promyje, aby se odstranila nenavázaná protilátka, a následuje přidání substrátu/chromoforu, jako je alkalická fosfatáza (AP) nebo křenová peroxidáza (HRP) na destičku, což vede ke změně barvy. Ke změně barvy vzorku dochází buď hydrolýzou fosfátových skupin ze substrátu pomocí AP, nebo oxidací substrátů pomocí HRP. Mezi výhody použití přímé ELISA patří eliminace zkřížené reaktivity sekundárních protilátek a díky menšímu počtu kroků je rychlejší než nepřímá ELISA. Mezi její nevýhody patří nízká citlivost ve srovnání s ostatními typy ELISA a vysoká cena reakce.
Přímá ELISA
Kroky nepřímé ELISA jsou totožné s přímou ELISA, s výjimkou dalšího promývacího kroku a typů protilátek přidávaných po odstranění pufru. Nepřímá ELISA vyžaduje dvě protilátky, primární detekční protilátku, která ulpívá na zájmovém proteinu, a sekundární enzymově vázanou protilátku komplementární k primární protilátce. Nejprve se přidá primární protilátka, následuje promývací krok a poté se přidá a inkubuje sekundární protilátka konjugovaná s enzymem. Poté následují stejné kroky jako u přímé ELISA, které zahrnují promývací krok, přidání substrátu a detekci změny barvy.
Přímá ELISA má ve srovnání s přímou ELISA vyšší citlivost. Je také levnější a flexibilnější díky mnoha možným primárním protilátkám, které lze použít. Jedinou hlavní nevýhodou tohoto typu ELISA je riziko zkřížené reaktivity mezi sekundárními detekčními protilátkami.
Sendvičová ELISA
Na rozdíl od přímé a nepřímé ELISA začíná sendvičová ELISA záchytnou protilátkou nanesenou na jamky destičky. Označuje se jako „sendvičová“, protože antigeny jsou vloženy mezi dvě vrstvy protilátek (záchytné a detekční protilátky). Po přidání záchytné protilátky se destičky zakryjí a inkubují přes noc při 4 °C. Po dokončení potahování se destičky promyjí PBS a poté se pufrují/blokují BSA. Promývání pufrem se provádí nejméně 1-2 hodiny při pokojové teplotě. Nakonec se destička před přidáním antigenu ještě jednou promyje PBS.
Na destičky se poté přidá zájmový antigen, který se naváže na záchytnou protilátku, a inkubuje se 90 min při 37 °C. Destička se znovu promyje a poté se na ni přidá primární detekční protilátka a inkubuje se další 1 až 2 hodiny při pokojové teplotě, poté následuje promytí pufrem. Poté se přidá sekundární protilátka konjugovaná s enzymem a inkubuje se další 1 až 2 hodiny. Destička se znovu promyje a přidá se substrát, aby došlo ke změně barvy. Sendvičová ELISA má nejvyšší citlivost ze všech typů ELISA. Hlavními nevýhodami tohoto typu ELISA jsou časová a finanční náročnost a nezbytné použití „párových“ (divalentních/multivalentních antigenů) a sekundárních protilátek.
Kompetitivní ELISA
Kompetitivní ELISA testuje přítomnost protilátky specifické pro antigeny v testovaném séru. Tento typ ELISA využívá dvě specifické protilátky, protilátku konjugovanou s enzymem a další protilátku přítomnou v testovaném séru (pokud je sérum pozitivní). Kombinace obou protilátek v jamkách umožní soutěžení o vazbu na antigen. Přítomnost barevné změny znamená, že test je negativní, protože protilátka konjugovaná s enzymem navázala antigeny (nikoli protilátky testovacího séra). Nepřítomnost barvy znamená pozitivní test a přítomnost protilátek v testovaném séru. Kompetitivní ELISA má nízkou specifitu a nelze ji použít u zředěných vzorků. Její výhodou je však menší potřeba čištění vzorku, možnost měření velkého rozsahu antigenů v daném vzorku, možnost použití pro malé antigeny a nízká variabilita
.