Výsledky a diskuse
Test „autofagického toku“ popsaný v Jiang et al. je kvantitativní reportérový test zeleného fluorescenčního proteinu (GFP), který měří ratiometrické změny polyQ-GFP na volný GFP pomocí analýzy Western blot. Multicistronní reportérový konstrukt byl navržen tak, aby kódoval dva proteiny: polyQ spojený s N-koncovým GFP a volný GFP. Virová sekvence 2A (v2A) byla umístěna jako spojovací oblast mezi sekvence kódující oba proteiny, aby umožnila stechiometrickou translaci dvou samostatných proteinů z jednoho otevřeného čtecího rámce (obr. 1a) .
Vytvoření předpokládaných konstruktů Q52, Q31 a Q10-GFP pomocí multicistronického reportérového konstruktu Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP. a Mapa vektorů konstruktu Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP. b Přehled použití degenerovaných kodonů CAA a CAG v tomto konstruktu. c Chromatografie konstruktu zobrazující náhodně rozmístěné glutaminové kódovací triplety CAG a CAA. d Schematické znázornění vylučovací amplifikace konstruktu obsahujícího Q80-GFP na základě PCR za účelem vytvoření polyQ konstruktů s nižším počtem glutaminových opakování. e Sekvence Q80 znázorňující vazebná místa primerů Q52, Q31 a Q10. f Sekvence primerů určených k vytvoření konstruktů Q52, Q31 a Q10. g Analytická elektroforéza v agarózovém gelu pro každý z předpokládaných vektorů Q80, Q52, Q31 a Q10 s použitím primerů lemujících oblast polyQ. Byly pozorovány velikosti produktů PCR ~ 270, ~ 180, ~ 120 a ~ 60 bp pro zamýšlené putativní konstrukty Q80, Q52, Q31 a Q10-GFP
Navrhli jsme sekvenci polyQ obsahující 80 glutaminových opakování (Q80). Sekvence byla navržena tak, aby měla nízkou podobnost opakování náhodným prokládáním tripletů CAG kódujících glutamin s triplety CAA kódujícími glutamin (obr. 1b, c). Nukleotidové záměny byly provedeny od oka, aby se vytvořil částečně náhodný vzor. Tento neopakující se design sekvence by měl nejen zvýšit stabilitu sekvence během množení v bakteriích, ale také umožnil navrhnout primery PCR, které se annealizují na specifické oblasti sekvence.
Výše popsaný konstrukt Q80-GFP-v2A-GFP byl komerčně syntetizován (Biomatik Corporation) (viz doplňkový soubor 1) a subklonován přes restrikční místa BamHI a ClaI do vektoru pro přenos genu založeného na transpozonu Tol2, pT2AL200R150G (dále jen Tol2), který je k dispozici v laboratoři Kawakami (obr. 1). 1a a viz doplňkový soubor 2).
Konstrukty PolyQ s nižším počtem glutaminových repetic byly vytvořeny vylučovací amplifikací konstruktu Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP na základě PCR. Primery byly navrženy tak, aby amplifikovaly kolem vektoru s vyloučením definovaného počtu glutaminových repetic a vytvořily tak zájmové konstrukty (obr. 1d-f). Naším cílem bylo vytvořit vektory s přibližně 52 (Q52), 31 (Q31) a 10 (Q10) glutaminovými repeticemi. Předpokládané vektory Q52 a Q31 byly vytvořeny pomocí stejného reverzního primeru ve spojení s různými dopřednými primery. Tento společný reverzní primer amplifikoval 2 glutaminové repetice, zatímco přední primery amplifikovaly dalších 50 a 29 glutaminových repeticí potřebných k vytvoření vektorů Q52 a Q31. Poloha reverzního primeru byla mírně posunuta, aby se optimalizovala amplifikace předpokládaného vektoru Q10, takže reverzní primer nyní amplifikoval 5 glutaminových repetic, zatímco přední primer amplifikoval zbývajících 5 glutaminových repetic (obr. 1d-f). Použitím přísných teplot žíhání v PCR reakci jsme dosáhli specifické vazby primerů. Produkty PCR extrahované z gelu a přečištěné byly fosforylovány, cirkulovány samoligací a následně transformovány do kompetentních buněk (viz další soubor 3). PCR s použitím primerů, které lemovaly oblast polyQ, ukázala přibližně očekávané velikosti produktů pro zamýšlené předpokládané vektory Q52, Q31 a Q10 (obr. 1g). Vytvořené konstrukty byly sekvenovány, aby se zjistilo, zda jsou přítomny očekávané počty opakování polyQ. Zatímco konstrukt Q52 měl očekávaný počet glutaminových opakování (obr. 2a, b), sekvenování odhalilo drobné nesrovnalosti s očekávaným počtem polyQ u dalších dvou konstruktů, kde vektor Tol2-Q31-GFP-v2A-GFP měl 21 glutaminových opakování (dále jen Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP) (obr. 3). 2c, d) a vektor Tol2-Q10-GFP-v2A-GFP měl 11 glutaminových repetic (dále jen Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP) (obr. 2e, f). Další analýza ukázala, že vytvořená sekvence Q21 byla odvozena přímo z původní sekvence a ztráta glutaminových opakování byla způsobena vazbou dopředného primeru Q31 o 30 bp níže od předpokládaného vazebného místa. Naproti tomu dodatečná glutaminová repetice v sekvenci Q11 byla vytvořena de novo, přídavkem kodonu CAA.
Mapa vektorů a sekvenční analýza konstruktů kódujících Q52, Q21 a Q11-GFP vytvořených excizní amplifikací na základě PCR. a Mapa vektorů konstruktu Tol2-Q52-GFP-v2A-GFP. b Chromatografie konstruktu Q52. c Mapa vektoru konstruktu Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP. d Chromatografie konstruktu Q21. e Mapa vektoru konstruktu Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP. f Chromatograf konstruktů Q11
Pro studium kinetiky agregace a „autofagického toku“ proteinu polyQ in vivo jsme vstříkli vytvořené vektory polyQ (25 ng/μl) a transpoziční mRNA (25 ng/μl) do skupin embryí zebřiček ve stadiu jedné buňky (obr. 3a, b). U každé skupiny byla provedena analýza Western blot s protilátkou anti-GFP z lyzátů embryí 24 h po oplození (hpf) (10 embryí na vzorek). Jako kontroly byly zahrnuty prázdný vektor Tol2 (25 ng/μl) a transpoziční mRNA (25 ng/μl) injektovaných a neinjektovaných embryí. Embrya injektovaná konstruktem polyQ vytvářela podle očekávání dva pásy detekované protilátkou anti-GFP; GFP navázaný na polyQ (polyQ80-GFP o velikosti ~ 48 kDa, polyQ52-GFP o velikosti ~ 38 kDa, polyQ21-GFP o velikosti ~ 33 kDa a polyQ11-GFP o velikosti ~ 31 kDa) a volný GFP (~ 27 kDa) (obr. 3c). Každý z konstruktů polyQ-GFP exprimujících lyzáty embryí také vykazoval slabší pás vyšší velikosti proteinu odpovídající plné délce konstruktu polyQX-GFP-v2A-GFP (polyQ80-GFP-v2A-GFP při ~ 75 kDa, polyQ52-GFP-v2A-GFP při ~ 65 kDa, polyQ21-GFP-v2A-GFP při ~ 60 kDa a polyQ11-GFP-v2A-GFP při ~ 58 kDa). Tento pás představuje ~ 10 % celkového proteinu, který je při použití sekvenčního systému v2A překládán jako jediný protein plné délky . Poměry Q80-GFP:GFP, Q52-GFP:GFP, Q21-GFP:GFP a Q11-GFP:GFP jsou ~ 5, ~ 4, ~ 2 a ~ 1 (obr. 3d). Vzhledem k tomu, že sekvence v2A umožňuje stechiometrickou translaci proteinů polyQ-GFP a GFP, teoreticky by měl být poměr polyQ-GFP:GFP 1. Pozorované větší poměry mohou naznačovat akumulaci těchto proteinů. Tato pozorování jsou v souladu s literaturou, kde bylo prokázáno, že fúzní konstrukty polyQ-GFP obsahující více než 19 glutaminových zbytků se v transfekovaných buňkách hromadí v závislosti na délce. Tato pozorování nás vedou k závěru, že naše konstrukty Tol2-QX-GFP-v2A-GFP poskytují užitečný nástroj pro studium „autofagického toku“ in vivo na modelu larvální zebřičky.
Analýza exprese konstruktu Tol2-QX-GFP-v2A-GFP u D. rerio. Embryím zebřiček bylo injikováno 25 ng/µl konstruktu Tol2-QX-GFP-v2A-GFP a 25 ng/µl mRNA kódující transpozázu Tol2. a Brightfield (horní panely) a fluorescenční (spodní panely) snímky levého bočního pohledu na oblast hlavy a trupu embrya zebřičky exprimující Q80, Q52, Q21 a Q11-GFP, ~ 24 hpf. b Brightfield (horní panely) a fluorescenční (spodní panely) snímky levé strany trupu a ocasu embrya zebřičky exprimující Q80, Q52, Q21 a Q11-GFP, ~ 24 hpf. c Western blot analýza exprese konstruktů Qx-GFP u D. rerio. Proteiny byly izolovány z embryí exprimujících konstrukty Q80, Q52, Q21 a Q11-GFP ~ 24 hpf. Proteiny byly rozděleny na 10% SDS-PAGE gelu a přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Na membránu byla nanesena protilátka proti GFP. „Prázdný“ vektor Tol2 má exprimovaný gen GFP, který je nahrazen během vkládání konstruktu. d Kvantifikace Western blotu. Je uvedena intenzita GFP pro každý očíslovaný pás Western blotu a poměr Qx-GFP k volnému GFP
Závěr
Závěrem tato studie poskytuje robustní a snadno přijatelné řešení pro generování polyQ repetic blízkých zamýšlené délce. Za účelem generování přesného počtu glutaminových repetic lze provést následná kola amplifikace s pozměněnými sekvencemi primerů. Kromě toho lze prodloužit délku primeru, aby se zvýšila specifičnost žíhání primeru na templát. Naše technika má několik výhod oproti stávajícím metodám amplifikace repetitivních oblastí pomocí PCR a jejím cílem je minimalizovat vznik nespecifických produktů PCR a chybných opakování využitím redundance kodonů genetického kódu k vytvoření synonymní kódující sekvence DNA s omezeným počtem opakování. Náš přístup se navíc neomezuje pouze na generování polyQ opakovaných sekvencí, ale lze jej zobecnit i na generování jiných nukleotidových opakovaných sekvencí. Naše metoda je navíc relativně levná, protože pouze počáteční konstrukt polyQ80-GFP-v2A-GFP vyžaduje komerční syntézu, jejíž cena závisí na ceně za nukleotidovou bázi, délce, čistotě a hmotnosti. Všechny ostatní potřebné materiály jsou standardní činidla používaná pro molekulární klonování. Souhrnně řečeno, popsaná technika poskytuje snadno přijatelné a cenově dostupné řešení pro generování opakovaně kódujících sekvencí DNA, s nimiž lze manipulovat podle potřeby.