Detekce endotoxinu – z lyzátu limulus amebocytů na rekombinantní faktor C

Gramnegativní bakteriální endotoxin je biologický pyrogen, který při intravenózním podání způsobuje horečku. Endotoxin, známý také jako lipopolysacharid (LPS), se nachází ve vnější membráně gramnegativních bakterií. Během gramnegativní sepse endotoxin stimuluje hostitelské makrofágy k uvolňování zánětlivých cytokinů. Nadměrný zánět však způsobuje selhání mnoha orgánů a smrt. Endotoxiny, které jsou všudypřítomnými patogenními molekulami, jsou postrachem farmaceutického průmyslu a zdravotnické komunity. Včasná a citlivá detekce endotoxinů má proto zásadní význam pro prevenci endotoxémie. Limulus amebocytární lyzát (LAL) se již ~30 let široce používá k detekci endotoxinu při zajišťování kvality injekčních léčiv a zdravotnických prostředků. LAL představuje kaskádu serinových proteáz, které jsou spuštěny stopovým množstvím endotoxinu a na konci reakce se vytvoří gelová sraženina. Faktor C, který normálně existuje jako zymogen, je základem této koagulační kaskády. In vivo je faktor C dokonalým biosenzorem, který podkováře upozorní na přítomnost gramnegativního útočníka. Konečný hemostatický bod zachytí vetřelce, usmrtí ho a omezí další infekci. Nicméně jako nástroj pro detekci endotoxinu in vitro představují rozdíly v citlivosti a specifičnosti LAL vůči endotoxinu a snižující se zásoby krabů podkovovitých pro biotechnologický průmysl stále větší výzvu. To si vyžádalo inovaci alternativního testu na endotoxin. Faktor C se tak stal jasným, i když složitým cílem pro snahu o rekombinantní technologii. Tato kapitola dokumentuje zpětnou cestu od těžby přírodního krevního lyzátu ohroženého druhu k monumentálnímu úsilí genového inženýrství, jehož cílem je výroba rekombinantního faktoru C (rFC). RFC je molekula o velikosti 132 kDa, která byla vyrobena jako proenzym indukovatelný přítomností stopového množství endotoxinu. RFC tvoří základ soupravy „PyroGene“, což je nový mikroenzymatický endotoxinový diagnostický test pro vysoce výkonný screening endotoxinu. Pomocí rFC společnost Lonza Inc. vytvořila „PyroSense“, který slouží jako kontrolní body biotechnologické výrobní linky. Od klonování až po komerční aplikace tak rFC zahájil novou éru testování endotoxinu pro zajištění kvality biomedicínských produktů a pro zdravotnický průmysl, přičemž šetří ohrožené podkovovité kraby.