Elucidating the functional role of Mycobacterium smegmatis recX in stress response

Hypoxie způsobuje zvýšení exprese M. smegmatis recA a recX genů

Během infekce a proliferace je M. tuberculosis vystavena fyziologickým stresovým podmínkám, jako je hypoxie a kyselý pH stres, které by mohly ohrozit její přežití38,39,40 . Například akutní hypoxický stres zastavuje replikaci DNA a vyvolává silné poškození DNA41,42,43. Při poškození DNA začíná docházet ke zvýšení exprese genů dráhy SOS, včetně umuDC, polB, recN, sulA, uvrA, uvrB a uvrD44,45,46 . Za tímto účelem poskytlo profilování exprese genů vyvolané hypoxií u M. smegmatis a M. tuberculosis během latentní infekce cenné poznatky o povaze latentní tuberkulózy a její léčbě47.

Předchozí studie u M. tuberculosis48, Thiobacillus ferrooxidans49 a Streptomyces lividans50 prokázaly, že recA je ko-transkribován s recX. Dále bylo zjištěno, že nadměrná exprese recA (pozitivní regulátor SOS odpovědi) je toxická v nepřítomnosti recX u některých bakteriálních druhů, včetně Pseudomonas aeruginosa51, S. lividans50, M. smegmatis52 a Xanthomonas oryzae53. Tato zjištění jsou v souladu s představou, že RecX působí jako antirekombináza, která potlačuje nevhodné rekombinační události podporované RecA14. Naproti tomu nadměrná exprese RecA v kmeni E. coli ΔrecX není škodlivá a delece recX nemá vliv na expresi recA54. Transkripce recX v E. coli je v porovnání s recA za normálních růstových podmínek snížena z důvodu existence místa ukončení transkripce mezi kódujícími sekvencemi recA a recX. Transkript mRNA recA-recX, který je výsledkem transkripčního přečtení, se však hromadí v rozsahu 5-10 % celkového obsahu mRNA recA54. Transkript recX byl během vegetativního růstu E. coli sotva detekovatelný, ale k robustní expresi recX dochází po ošetření látkami poškozujícími DNA15,55.

Genomy M. smegmatis i M. tuberculosis obsahují po jedné kopii recA a recX v jednom operonu. Pro zkoumání exprese a regulace těchto genů při aerobním a hypoxickém růstu u M. smegmatis, běžně používaného náhradního modelu pro M. tuberculosis, byla měřena relativní abundance mRNA v různých růstových fázích pomocí testu RT-qPCR a normalizována k abundanci konstitutivně exprimovaného genu 16S rRNA. Hodnoty prahu cyklu (Ct) pro mRNA recA a recX M. smegmatis byly normalizovány vůči hodnotě Ct genu16S rRNA. Na rozdíl od E. coli15,55 bylo významné množství transkriptů mRNA recA pozorováno v časné log fázi za aerobních i hypoxických kultivačních podmínek (obr. 1A). Zajímavé je, že hypoxické podmínky zvýšily akumulaci mRNA recA 1,5krát v mid-log fázi a poté se snížila, jakmile buňky vstoupily do stacionární fáze. Podobný průběh byl pozorován u množství mRNA recX za aerobních i hypoxických podmínek, i když ve snížené míře (obr. 1B). Tato pozorování podporují myšlenku, že oba geny jsou ko-transkribovány a koordinovaně regulovány za aerobních a hypoxických růstových podmínek. Zajímavé je, že nebyl pozorován žádný rozdíl v množství mRNA za aerobních a hypoxických růstových podmínek v časné log fázi. Transkripční profily markerových genů specifických pro růstovou fázi M. smegmatis (sigH2 a sigH7)56 byly použity ke zjištění časů časné-log, střední-log a stacionární fáze (obr. 1C). U klinických kmenů M. tuberculosis rezistentních k více léčivům byly zjištěny vyšší hladiny mRNA recA i recX než u kmenů citlivých k léčivům a hladiny mRNA recX se zvyšovaly současně s nárůstem mRNA recA57.

Je však třeba poznamenat, že hladiny mRNA nelze použít jako náhradu za odpovídající hladiny proteinů. Proto bylo množství proteinů RecA a RecX v M. smegmatis měřeno za aerobních a hypoxických podmínek pomocí testu Western blot s použitím protilátek anti-RecA a anti-RecX. Jako kontrola proteinového zatížení byl použit GroEL. Denzitometrická analýza imunoblotů ukázala, že buňky akumulují vyšší hladiny RecA za hypoxických podmínek růstu ve srovnání s aerobními podmínkami (obr. 2A,B). Srovnávací analýza ukázala, že buňky konzistentně akumulovaly 2krát vyšší hladiny RecA ve středních log fázích ve srovnání s ranou log fází za aerobních růstových podmínek, které se ve stacionární fázi snížily na hladiny pozorované v rané log fázi (obr. 2A,B). Podobný průběh byl pozorován u RecX, i když hladiny byly méně výrazné než u RecA (obr. 2A,C). Přestože vzorce exprese mRNA a proteinů byly srovnatelné, byly zaznamenány důležité rozdíly. Za prvé, protein RecX byl během hypoxických podmínek stěží detekovatelný v časné log fázi. Za druhé, množství mRNA a proteinu RecA bylo vyšší ve srovnání s RecX.

Ačkoli tyto výsledky naznačují, že geny recA a recX M. smegmatis jsou indukovány za hypoxických podmínek, neexistuje korelace mezi množstvím mRNA recX a odpovídajícím proteinem v časné log fázi. Bylo prokázáno, že jak M. tuberculosis, tak M. smegmatis stabilizují své transkripty mRNA za podmínek inhibice růstu58,59,60. Mezi možnými mechanismy se ukázalo, že u mykobakterií v reakci na hypoxii hraje roli přeprogramování tRNA a selektivní translace v závislosti na kodonu61. Jedním z možných vysvětlení nedostatečné korelace mezi hladinou mRNA recX versus hladinou proteinu v rané fázi log by mohla být translační represe mRNA recX.

Konstrukce mutantních kmenů ΔrecX a ΔrecA ΔrecX

Rozdíl v hladinách proteinů RecA a RecX u M. smegmatis naznačuje možnou regulaci genové exprese na úrovni transkripce. U mnoha dosud studovaných bakterií se gen recX nachází na stejném kódujícím vlákně za genem recA a oba geny jsou ko-transkribovány48,50,53,54,62,63 . V lokusu lexA-recA-recX patogenů rodu Xanthomonas je však každý gen exprimován z vlastního promotoru64. Kromě toho jsou u D. radiodurans65,66, B. subtilis67 a N. gonorrhoeae26 geny recA a recX odděleny délkou několika set kb a přepisovány z vlastních promotorů.

U řady mykobakteriálních druhů a také u několika dalších bakterií se 5′ oblast kódující sekvence recX překrývá s 3′ oblastí genu recA. U M. smegmatis48 je překryv dlouhý 32 bp, zatímco u M. tuberculosis68 a M. leprae69 je překryv 35 bp. Vliv delece recX na fenotypové charakteristiky byl studován u různých organismů7,10. Mutanti s knockoutem recX vykazují řadu fenotypů souvisejících s funkcí RecA: inaktivace recX u B. subtilis způsobila, že buňky byly citlivé na MMS a H2O225, mutanti recX u S. lividans vykazovali sníženou odolnost vůči poškození UV zářením42 a mutant recX u N. gonorrhoeae vykazoval malé snížení schopnosti přežít poškození DNA, které bylo způsobeno dvouřetězcovými zlomy26. Vliv delece genů recA i recX na růstové vlastnosti a opravu poškození DNA však nebyl u žádného organismu zkoumán. Navíc není plně pochopena úloha recX u mykobakterií in vivo.

Předchozí studie prokázaly, že kmen M. smegmatis ΔrecA vykazoval citlivost vůči poškození DNA vyvolanému UV zářením a nedokáže podporovat HR52. Kombinovali jsme mutaci recA s delecí recX, abychom prozkoumali účinky dvojitých mutací. Za tímto účelem byly vytvořeny kmeny M. smegmatis mc2155 recX single a recArecX double mutant. Jako kontrola byl pro přímé srovnání znovu vyhodnocen účinek delece recA u M. smegmatis. Metodou rekombinace, která vychází z protokolu vyvinutého pro M. tuberculosis a M. bovis BCG28 , byly vytvořeny mutanty M. smegmatis mc2155 ΔrecA a ΔrecAΔrecX pomocí 3,279 kb a 3,302 kb lineárních konstruktů ΔrecA::hyg a ΔrecAΔrecX::hyg AES. Restrikčním štěpením příslušných plazmidů pomocí EcoRV bylo získáno přibližně 100 ng lineárních fragmentů AES DNA (obr. 3A). Ty byly transformovány do kompetentních rekombinačních buněk M. smegmatis mc2155:pJV5370. Po 4-5 dnech inkubace bylo nalezeno 8-10 kolonií rezistentních vůči Hyg pro mutanty ΔrecX a ΔrecAΔrecX. Domnělé mutantní kmeny byly prověřeny pomocí PCR, aby se zjistilo, zda byly z chromozomu odstraněny geny recX a recArecX (údaje nejsou uvedeny). Správní mutanti byli pěstováni na agarovém médiu 7H10 Middlebrook po dobu 5-8 generací, aby došlo ke ztrátě pJV53.

Genotypová a fenotypová analýza M. smegmatis ΔrecX a ΔrecAΔrecX mutantů

Po screeningu pomocí PCR byly získány vždy 2 knockout mutanty ΔrecX a ΔrecAΔrecX kmene M. smegmatis mc2155. Mutanty ΔrecX a ΔrecAΔrecX byly charakterizovány mapováním restrikčními enzymy a Southernovou hybridizací (obr. 3). Po hybridizaci s příslušnými radioaktivně značenými sondami byl u divokého typu M. smegmatis mc2155 pozorován fragment o velikosti 4,1 kb. U mutantů ΔrecX a ΔrecAΔrecX byly pozorovány předpokládané fragmenty o velikosti 3,14 kb a 2,09 kb (obr. 3B,C). Oba tyto pásy jsou menší než 4,1 kb, což naznačuje, že geny recX a recArecX byly odstraněny alelickou záměnou. Frekvence alelické výměny s ohledem na recX a recArecX se pohybovala v rozmezí 70 %, resp. 80 %.

Jednou výhradou této analýzy je, že pozorované účinky mutací ΔrecX a ΔrecAΔrecX mohou být důsledkem polárních účinků vložení genu pro rezistenci k hygromycinu. Obecně by genetické změny v okolí lokusu recA-recX mohly vést k polárním účinkům na expresi genů navazujících na lokus recA-recX. Ke zkoumání potenciálních polárních účinků byly provedeny dva nezávislé experimenty. Nejprve byly mutanty ΔrecX a ΔrecAΔrecX doplněny funkčními kopiemi genů recA a recX. U transformantů byla hodnocena jejich schopnost růst ve standardním kultivačním médiu a ochrana mutantních buněk před UV zářením. Desetinásobná sériová ředění byla nanesena na agarové plotny 7H10 a analyzována. Jak ukazuje obr. 4A,B, divoký typ recA částečně doplňoval mutantní kmeny ΔrecA a ΔrecAΔrecX, jak vyplývá z jejich schopnosti podporovat růst a poskytovat ochranu před UV zářením. Divoký typ recX však nedokázal zachránit fenotyp mutantních kmenů ΔrecAΔrecX pozorovaný při indukci poškození DNA UV zářením. Vzhledem k tomu, že delece recX neměla žádný znatelný vliv na růst za normálních podmínek a za podmínek poškození DNA, vykazoval ΔrecX a jeho odpovídající komplementovaný kmen podobný růst jako kmen divokého typu.

Druhé jsme hodnotili expresi dvou genů M. smegmatis mc2155, gluD (MSMEG_2725) a glnH (MSMEG_2726), které se nacházejí za lokusem recA recX v mutantních kmenech ΔrecA ΔrecX a ΔrecX ve srovnání s kmenem divokého typu. Jako pozitivní kontrola byl použit gen M. smegmatis hyd2 (MSMEG_2720) umístěný před lokusem recA-recX. Celková RNA byla připravena z divokého typu, ΔrecA ΔrecX a mutantního kmene ΔrecX. Relativní množství genových transkriptů bylo stanoveno pomocí kvantitativní RT-qPCR a normalizováno na množství konstitutivně exprimovaného chromozomálního genu 16S rRNA. Hladiny exprese byly měřeny z buněk pěstovaných v pozdní exponenciální růstové fázi. Ve všech případech byly profily genové exprese jak upstream, tak downstream ORF u divokého typu a mutantních kmenů podobné (obr. 4C). Celkově tyto výsledky vylučují možnost, že by vložení genu pro rezistenci k hygromycinu způsobovalo polární účinky.

Mutantní kmeny M. smegmatis ΔrecA a ΔrecA ΔrecX vykazují zhoršený růst a snížený výtěžek buněk ve srovnání s kmenem divokého typu

K charakterizaci kmene M. smegmatis ΔrecX a mutantních kmenů ΔrecA ΔrecX byly měřeny růstové profily divokého typu a knockoutovaných kmenů v bujónu 7H9 Middlebrook při 37 °C (obr. 5). Delece recX neměla na růst M. smegmatis žádný znatelný vliv (ve srovnání s kmenem divokého typu). Za podobných podmínek delece recA výrazně prodloužila délku lag fáze a současně snížila exponenciální fázi růstu, což naznačuje, že recA hraje roli v růstu a životaschopnosti M. smegmatis. Tyto výsledky jsou navíc v souladu se známou funkcí RecA při záchraně zastavených nebo zhroucených replikačních vidlic71,72,73. Protože geny recA a recX tvoří jeden operon, byl zkoumán dopad jejich delece na růst M. smegmatis. Kmen s knockoutem ΔrecA ΔrecX vykazoval růstový fenotyp, který byl prostřední mezi mutantem ΔrecA a kmenem divokého typu; růst v pozdní logaritmické a stacionární fázi byl však podobný jako u kmenů ΔrecA a divokého typu.

Delece recA, ale nikoli recX, činí M. smegmatis citlivější k látkám poškozujícím DNA

Podobně jako u jiných eubakterií hraje mykobakteriální protein RecA klíčovou roli v regulaci SOS odpovědi při poškození DNA74,75,76,77. Abychom otestovali, zda absence recArecX a recX ovlivňuje schopnost M. smegmatis účinně opravovat poškozenou DNA, byli mutanti vystaveni řadě látek s různým mechanismem poškození DNA. V těchto experimentech byl stres vyvolán vystavením mutantních kmenů ΔrecA, ΔrecX a ΔrecA ΔrecX UV záření, MMS, H2O2 nebo ciprofloxacinu během exponenciální fáze (OD600 0,6) bakteriálního růstu. Po tříhodinové inkubaci byly buňky promyty a jejich životaschopnost byla stanovena na základě desetinásobného sériového ředění kultur na agarových plotnách Middlebrook 7H10 obsahujících hygromycin (100 µg/ml). Nejvhodnější koncentrace/dávka látek poškozujících DNA byla určena po vyhodnocení rozdílů v životaschopnosti buněk mezi kmeny pomocí destičkových testů. V nepřítomnosti látek poškozujících DNA vykazovaly všechny kmeny podobnou úroveň životaschopnosti buněk (obr. 6). Naproti tomu v přítomnosti látek poškozujících DNA vykazoval kmen ΔrecA výrazný růstový defekt doprovázený stonásobným snížením účinnosti množení ve srovnání s kmenem divokého typu. Tento fenotyp je v souladu s dostupnou literaturou. Naproti tomu letální účinek UV záření, MMS nebo ciprofloxacinu, ale nikoli H2O2, byl částečně blokován delecí genu recX v kmeni ΔrecA. Ačkoli důvod absence účinku H2O2 není jasný, použitá koncentrace pravděpodobně nebyla dostatečně vysoká, aby ovlivnila růst. Zajímavé je, že kmen ΔrecX vykazoval mírně odolnější fenotyp vůči všem čtyřem látkám poškozujícím DNA než kmen ΔrecA ΔrecX, což naznačuje možný zisk funkce v důsledku ztráty genu recX. Vzhledem k těmto výsledkům je zřejmé, že recA hraje aktivní roli v SOS odpovědi a že citlivost k látkám poškozujícím DNA je u kmene ΔrecX mírně potlačena.

Přežití po ošetření různými koncentracemi látek poškozujících DNA

Mycobakterie jsou vystaveny řadě nepříznivých stresových podmínek, jako jsou oxidační, nutriční a lékové stresy78,79,80,81,82 . Pro další zkoumání rozdílů v životaschopnosti buněk byly provedeny experimenty, při nichž byla životaschopnost buněk měřena pomocí jednotek tvořících kolonie (CFU). Nejprve byla testována životaschopnost mutantů M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX a ΔrecAΔrecX ve srovnání se životaschopností divokého typu tím, že byly vystaveny rostoucím koncentracím MMS. Kmeny byly kultivovány v přítomnosti uvedených koncentrací MMS, dokud kultury nedosáhly OD600 0,6. Životaschopnost buněk byla zjišťována nanesením předem určeného počtu buněk na agarové plotny 7H10. Buňky byly považovány za živé, pokud byly schopny se dělit a tvořit kolonie. Mutanti na rozdíl od kmene divokého typu vykazovali zvýšenou citlivost k MMS v závislosti na koncentraci. Kvantitativní analýza ukázala, že mutant ΔrecA vykazoval relativně vyšší citlivost k MMS, která se zvyšovala s rostoucí koncentrací MMS (obr. 7A). V případě ΔrecX byly buňky ~2krát méně citlivé na MMS ve srovnání s buňkami ΔrecA. Na druhou stranu mutant ΔrecA ΔrecX vykazoval větší citlivost k MMS na rozdíl od mutanta ΔrecX. Citlivost mutanta ΔrecX k MMS naznačuje, že recX může mít kromě RecA ještě neidentifikované cíle. Tento předpoklad je třeba dále zkoumat.

Další citlivost M.M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX a ΔrecA ΔrecX mutantních kmenů vzhledem ke kmeni divokého typu byly stanoveny jejich vystavením zvyšujícím se koncentracím H2O2. Výsledky ukazují, že mutant ΔrecA byl k tomuto ošetření méně citlivý (obr. 7B). Samotná delece recX nebo delece lokusu recA-recX měla na životaschopnost a proliferaci mutantních buněk v reakci na ošetření H2O2 jen malý vliv. Pozoruhodné je, že mutantní kmeny ΔrecA a ΔrecAΔrecX vykazovaly citlivý růstový fenotyp vůči UV záření a ciprofloxacinu, který je výrazně mnohem závažnější než vůči MMS nebo H2O2 (obr. 7C,D). Kmen ΔrecA navíc vykazoval větší citlivost na UV záření a ciprofloxacin než dvojitý mutantní kmen ΔrecA ΔrecX.

Exprese genů recA a recX je indukována poškozením DNA

Regulační elementy před genem recA nejsou konzervovány u všech mykobakteriálních druhů. Například gen recA M. tuberculosis je přepisován ze dvou promotorů: oba jsou indukovatelné poškozením DNA, i když různými mechanismy. Promotor P1 genu recA M. tuberculosis (proximálně od start kodonu) může být indukován po poškození DNA nezávisle na proteinech LexA a RecA. Naproti tomu promotor P2 (umístěný dále od start kodonu recA) je regulován LexA, který je funkčně analogický promotoru recA E. coli83,84,85. Zajímavé je, že mechanismus indukce poškození DNA u M. tuberculosis není u M. smegmatis zcela konzervován46,75 . Tato zjištění zdůrazňují potřebu porozumět expresi a regulaci genů recA a recX M. smegmatis a jejich roli v odpovědi na látky poškozující DNA.

Jak bylo popsáno výše, hypoxie způsobila zvýšení exprese genů recA a recX M. smegmatis (obr. 1). Pro další potvrzení domněnky, že exprese genů recA a recX M. smegmatis je indukovatelná poškozením, byla stanovena kinetika indukce s poškozením DNA a bez něj pomocí RT-qPCR. Vzorky celkové RNA byly připraveny z buněk M. smegmatis sklizených 0, 3, 6, 9 a 12 hodin po vystavení UV záření a také z neošetřených kultur a analyzovány podle popisu v části Metody. Výsledky neodhalily žádné významné rozdíly mezi hladinami transkriptů recA a recX v neošetřených buňkách. Naproti tomu byl pozorován výrazný nárůst transkriptů mRNA recA a recX 3 h po vystavení UV záření a poté mírný pokles. Porovnání dat RT-qPCR ukazuje na významné rozdíly mezi hladinami transkriptů recA a recX. Vystavení UV záření vedlo k ~8násobnému zvýšení mRNA recA oproti kontrole, zatímco recX o ~3násobek (obr. 8A,B). Ačkoli tedy mRNA recA a recX existují ve stejné transkripční jednotce, tyto výsledky podporují myšlenku, že produkce a/nebo stabilita transkriptu mRNA recX podléhá dalšímu posttranskripčnímu regulačnímu mechanismu.

Tyto výsledky nás vedly k provedení dalších experimentů s cílem určit kinetiku akumulace proteinů RecA a RecX v buňkách M. smegmatis s poškozením DNA nebo bez něj. Western blotové testy byly provedeny na lyzátech celých buněk s použitím polyklonálních protilátek vznesených proti RecA a RecX (obr. 8C). Kvantifikace Western blotů ukázala, že buňky obsahují významné množství proteinů RecA i RecX v neindukovaných buňkách (obr. 8D,E). Pro srovnání, v buňkách 3 h po vystavení UV záření bylo pozorováno dvojnásobné zvýšení množství RecA i RecX (oproti kontrole), které se poté snížilo. Důležité je, že indukce proteinů RecA a RecX vykazovala vzorec připomínající vzorec pozorovaný v buňkách za hypoxických podmínek (obr. 2), ačkoli mechanismy, kterými poškozují DNA, jsou pravděpodobně odlišné.

Závěrečné poznámky

Mnoho studií prokázalo, že recA a recX plní širokou škálu funkcí souvisejících s opravou DNA a rekombinací7,10 . Podle našich znalostí nebyly identifikovány podněty, které aktivují expresi genů recA a recX M. smegmatis. V této studii byly hodnoceny hladiny exprese těchto genů v buňkách při aerobním růstu a v reakci na různé stresové podmínky. U M. smegmatis, podobně jako u mnoha jiných bakteriálních druhů, patří recA a recX do stejného operonu a gen recX se nachází bezprostředně za genem recA a sdílí překrývající se kódující oblasti86. Bylo zjištěno, že látky poškozující DNA indukují expresi obou genů v různé míře; poměry exprese však mají podobný průběh. Zajímavé je, že hladiny RecA i RecX zůstávají vysoké za stresových podmínek ve srovnání s podmínkami aerobního růstu.

Několik studií prokázalo alternativní roli recX v rekombinačních opravách DNA podporovaných RecA. Zatímco protein RecX fyzicky interaguje s RecA a funguje jako silný inhibitor všech jeho známých funkcí u mnoha bakteriálních druhů14,46,48 , u N. gonorrhoeae a B. subtilis25,26 potencuje homologní rekombinaci. Pro získání poznatků o úloze recX v odpovědi na stres u mykobakterií byly zkonstruovány knockoutované mutanty recX a recArecX u M. smegmatis. Je zajímavé, že delece recX u M. smegmatis vedla k mírně odolnějšímu fenotypu vůči všem čtyřem látkám poškozujícím DNA, což naznačuje možný zisk funkce v důsledku ztráty genu recX. Molekulární podstata tohoto účinku není jasná, což se zdá být vhodné prozkoumat v budoucích studiích. Zatímco naše analýza byla zaměřena především na genetickou interakci mezi recA a recX v rekombinační dráze opravy DNA, zajímavé je, že recX zřejmě hraje důležitou roli v růstu bakterií. Celkově jsou tato zjištění v souladu s myšlenkou, že recX M. smegmatis hraje důležitou roli v procesech opravy/rekombinace DNA za nepříznivých podmínek, možná tím, že reguluje škodlivé účinky podskupiny dosud neznámých genů.

Použité zkratky jsou

DTT, dithiothreitol; EDTA, kyselina ethylendiamintetraoctová; kb, kilobáze; MMS, methylmethansulfonát; ODN, oligonukleotid; PAGE, polyakrylamidová gelová elektroforéza; PVDF, polyvinyliden difluoridová membrána; RT-qPCR, kvantitativní polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí; SDS, dodecylsulfát sodný; ssDNA, jednořetězcová DNA; SSC, 0.15 M NaCl-0,015 M pufr citrátu sodného (pH 7,0).