Důležitost fixace
Pro studium tkání mikroskopem je třeba je konzervovat (fixovat) a nakrájet na řezy dostatečně tenké, aby byly průsvitné. Fixace je rozhodujícím krokem při přípravě histologických řezů. Pokud není provedena za optimálních podmínek nebo pokud je fixace opožděna, může dojít k nevratnému poškození vzorku tkáně. Bez ohledu na to, jaká péče je následně věnována zpracování tkáně, mikrotomii a barvení, morfologické a histochemické informace, které lze ze vzorku získat, budou ohroženy.
Širokým cílem fixace tkáně je zachovat buňky a složky tkáně ve „stavu podobném živé tkáni“ nebo co nejméně pozměněné živé tkáni, a to takovým způsobem, aby bylo možné připravit tenké obarvené řezy. Volba fixačního prostředku a fixačního protokolu může záviset na dalších krocích zpracování a plánovaných konečných analýzách. Neexistuje dokonalé fixační činidlo, i když nejblíže k němu má formaldehyd. Proto je k dispozici řada fixativ, která lze použít v závislosti na typu přítomné tkáně a vlastnostech, které mají být prokázány.
Typ fixace
Fixace tkání lze dosáhnout chemickými nebo fyzikálními prostředky.
Fyzikální metody zahrnují zahřívání, mikrovlnění a kryokonzervaci (lyofilizaci).
Chemické fixace se obvykle dosahuje ponořením vzorku do fixačního prostředku (imerzní fixace) nebo, v případě malých zvířat nebo některých celých orgánů, jako jsou plíce, perfuzí cévního systému fixačním prostředkem (perfuzní fixace). Pro některé specializované histochemické postupy se fixativa příležitostně používají v parní formě. Například paraformaldehyd a tetroxid osmia lze použít k parní fixaci lyofilizovaných tkání.
- Zjistěte více o oblíbených fixačních roztocích
Mechanismus fixace
Dva hlavní mechanismy chemické fixace jsou zesíťování a koagulace.
Síťování zahrnuje tvorbu kovalentních vazeb jak uvnitř proteinů, tak mezi nimi, což způsobuje ztuhnutí tkáně, která tak odolává degradaci.
Koagulace je způsobena dehydratací proteinů pomocí alkoholů nebo acetonu. Tato činidla odstraňují a nahrazují volnou vodu v buňkách a tkáních a způsobují změnu terciární struktury proteinů destabilizací hydrofobních vazeb. Nazývá se také denaturace.
Faktory ovlivňující fixaci
- Teplota: Obecně platí, že zvýšení teploty zvyšuje rychlost fixace, ale také rychlost autolýzy a difúze buněčných prvků. Tradičně se za ideální teplotu nebo fixaci vzorků považuje teplota 0 až 4 °C. Nyní se fixace běžně provádí při pokojové teplotě.
- Velikost: tloušťka 1-4 mm
- Objemový poměr: Nejméně 15-20krát větší než objem tkáně
- Čas: 24 – 48 hodin
- PH: pH by se mělo udržovat ve fyziologickém rozmezí 4-9. pH pro uchování ultrastruktury by mělo být pufrováno v rozmezí 7,2 až 7,4.
Protokoly
- Metody a protokoly pro dekalcifikaci kostního materiálu
- Standardní protokol pro formalínem fixovanou tkáň zalitou do parafínu
Užitečné odkazy
- Proces fixace a Povaha fixativ
- Populární fixační roztoky
- Základní úvod do histologie
- Národní společnost pro histotechnologii
- Úvod do dekalcifikace
- Praktická příručka správné histologické praxe