Fluorescenční proteiny z A. victoria
Spektrální vlastnosti GFP nebo jeho variant spočívají ve struktuře aminokyselin tvořících chromofor (obrázek 1). Mohou to být tři aminokyseliny v polohách 65-67 nebo zbytky v blízkosti tohoto místa (např. YFP). Kromě hlavních mutací týkajících se chromoforu byl prováděn také výzkum dalších místně řízených mutagenezí s cílem zlepšit další faktory, jako je zrání proteinu a exprese v heterologních buněčných systémech (např. použití kodonů, skládání proteinu při fyziologické teplotě). Všimněte si, že A. victoria je relativně primitivní mořský organismus bez systému tělesného tepla.
I když je GFP jedním z nejoblíbenějších FP díky své jasnosti a vysoké fotostabilitě, má dvě hlavní nevýhody. Jsou jimi určitá citlivost na pH a mírná tendence k dimerizaci. Dimerizace nebo oligomerizace je problémem mnoha FP. Jejich preference ke vzájemné aglutinaci může způsobit artefakty nebo chybné interpretace týkající se umístění a funkce fúzovaného proteinu. Vědci však přišli s několika odpověďmi i na tento problém. Mutace na kritických pozicích (F223R, L221K a A206K), kde jsou nepolární aminokyseliny nahrazeny hydrofilními, vykazují sníženou dimerizaci. Všechny genetické změny, které vedou ke zlepšení spektrálních i praktických vlastností, jsou shrnuty pod názvem „vylepšené“ FP.
V případě wtGFP vedou vylepšení k EGFP (enhanced GFP) s jediným excitačním píkem při 488 nm namísto předchozího složitého absorpčního spektra při 395 nm a 475 nm. První mutovaná verze wtGFP (mutant S65T) vyvinutá Rogerem Tsienem a kol. byla pětkrát jasnější než původní a vykazovala kratší dobu zrání. Spolu s lepší účinností zrání při 37 °C, založenou na jiné mutaci (F64L), to hraje důležitou roli pro lidi, kteří se dívají na živé buňky.
Velmi zajímavou variantou GFP s jedním z největších Stokesových posunů je Sapphire. Mutace v poloze blízko chromoforu (T203I) vede ke změně excitačního maxima na 399 nm a emisního maxima na 511 nm. Jedná se o Stokesův posun o 112 nm. Emerald je další modifikace GFP se zlepšenou fotostabilitou a jasem a účinnějším skládáním v savčích buňkách.
Zatímco všechny zelené fluorescenční proteiny mají relativně vysoký jas, modré fluorescenční proteiny obvykle trpí sníženou intenzitou emise při mikroskopických aplikacích. Přesto se v optických testech používají kvůli jiným spektrálním vlastnostem. EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein) byl vytvořen několika koly mutací wtGFP. První z nich (Y66H) vynechala emisní pík ze zeleného do modrého spektra. Následovaly další mutace, čímž vznikl protein s excitačním maximem při 380 nm a emisním maximem při 448 nm. Tyto spektrální vlastnosti z něj činí partnera pro EGFP v mikroskopii FRET. Nejnovější modré fluorescenční proteiny s vyšším kvantovým výtěžkem a lepší fotostabilitou jsou Azurite, SBFP2 a EBFP2. Slibným nástupcem EBFP je protein s názvem Sirius, který se stal populárním díky své velmi vysoké toleranci k pH (stabilní od pH 3-9) a pověsti fluorescenčního proteinu s dosud nejkratší vlnovou délkou emise.
Druhou „modrou“ třídu variant GFP tvoří azurové fluorescenční proteiny: CFP. Substituce tyrosinu tryptofanem (Y66W) a další genetické úpravy vedou k fluorochromu se zvýšenou jasností a fotostabilitou. Tento ECFP má bimodální excitační a emisní spektrum při 433/445 nm a 475/503 nm. Jas je pouze asi 40 % jasu EGFP. Významnou variantou ECFP je Cerulean, který má vyšší extinkční koeficient a kvantový výtěžek. Je 1,5krát jasnější než ECFP a používá se jako partner FRET s YFP.
Mutace GFP, která přímo nemění jednu ze tří centrálních aminokyselin v chromoforu, vedla ke vzniku žlutých fluorescenčních proteinů. YFP mají společný threonin v poloze 203, který je vyměněn za tyrosin (T203Y). Tato aminokyselina je součástí β-barrelu a leží v těsné blízkosti chromoforu. Ve srovnání s GFP jsou excitační a emisní vlastnosti posunuty k delším vlnovým délkám s excitačním a emisním maximem při 514 nm a 527 nm (EYFP). Jednou z charakteristik EYFP je její citlivost na pH. Při pH 6,5 má EYFP pouze asi 50 % své fluorescence, což není vždy nevýhodou. Pokud jde o měření pH (např. vezikul, endozomů atd.), lze EYFP použít jako indikátor. Zajímavé je, že další mutace (Q69M) vyvinula lepší kyselou stabilitu a výrazně zlepšila jas (o 75 % jasnější než EGFP). Tento protein, který má ve srovnání s EGFP stále špatnou fotostabilitu, byl nazván Citrine. Další mutant YFP (F46L) vykazoval drasticky vyšší rychlost zrání a také lepší odolnost vůči pH. Tento protein byl pojmenován Venus a je častým FRET akceptorem s Ceruleanem.
.