Virus a buňky
Pokud není uvedeno jinak, všechny experimenty byly provedeny s použitím klinického izolátu chřipkového viru v buňkách MDCK A/Memphis/14/96-M (H1N1), který laskavě poskytl Dr. Robert Webster (St. Jude Children’s Hospital, USA). Viry popsané na obr. 5 laskavě poskytli kolegové uvedení v poděkování.
Buňky MDCK a buňky MDCK-SIAT1 stabilně transfekované 2,6-sialyltransferázou pro zvýšenou expresi oligosacharidů zakončených Neu5Ac2-6Gal byly popsány dříve . Oba typy buněk jsme množili v DMEM (Gibco) doplněném 2 mM L-glutaminem, 10% fetálním telecím sérem a antibiotiky (streptomycin, 100 mg/ml a penicilin, 100 U/ml).
Překryvná média
Jako tekuté udržovací médium (MM) pro virovou infekci jsme použili MEM Eagle obsahující L-glutamin, 0,1 % BSA (Sigma, A-0336), antibiotika a 1 μg/ml trypsinu TPCK (Sigma, T-1426).
Stoky 1,8 % Bacto-Agaru (BD, 214010) a 2 % methylcelulózy (Methocel MC, 3000-5500 mPa.s při 2 %, Fluka) v destilované vodě byly připraveny podle předchozího popisu .
Výrobce Avicelu RC/CL (FMC BioPolymer) laskavě poskytl tři typy Avicelu (RC-581, RC-591 a CL-661) pro testování. Zásobní suspenze Avicelu jsme připravili dispergací 2,4 g prášku Avicelu ve 100 ml destilované vody na standardním magnetickém míchadle po dobu 1 hodiny. Zásobní roztoky agaru, MC a Avicelu byly sterilizovány autoklávováním po dobu 20 minut při 121 °C a skladovány při pokojové teplotě.
Překryvy byly připraveny smícháním zásobních roztoků MC, Avicelu nebo roztaveného agaru se stejným objemem dvojnásobně silného udržovacího média. Abychom mohli měnit koncentraci MC a Avicelu v překryvech, ředili jsme původní zásobní roztoky sterilní vodou. Překryv agaru byl připraven při teplotě 42-44 °C, další dva překryvy byly připraveny při teplotě 20 nebo 37 °C.
Koncentrované (2,4%) zásoby Avicelu se během skladování obvykle neoddělovaly, zředěné překryvy na bázi Avicelu však byly méně stabilní. Pokud jsme to považovali za nutné, míchali jsme zásoby přípravku Avicel a překryvy přípravku Avicel jsme před použitím vždy promíchali buď protřepáním rukou, nebo vířením. Pomalé oddělování překryvů po jejich aplikaci na buněčné monovrstvy nemělo vliv na výsledky testů.
Test na plaky v 6jamkových destičkách
Jednu hodinu po infikování buněčných monovrstev 30-50 plakotvornými jednotkami viru v 1 ml udržovacího média bez trypsinu jsme odstranili virové inokulum, pokryli buňky 3 ml různých překryvných médií a inkubovali kultury při 35 °C v 5% atmosféře CO2. V případě překryvných médií MC a Avicel jsme dbali na to, abychom během inkubace nenarušovali destičky a zabránili tak tvorbě nerovnoměrných plaků. Po třech dnech inkubace jsme odstranili překryvy a fixovali buňky. Agar byl odstraněn kovovou špachtlí; MC, Avicel a tekuté nánosy byly odstraněny odsáváním. Buňky byly fixovány 4% roztokem paraformaldehydu v MEM po dobu 30 minut při 4 °C a promyty PBS. Všechny následné úpravy buněk byly prováděny při pokojové teplotě. Buňky jsme permeabilizovali a současně blokovali zbytkové aldehydové skupiny inkubací buněk po dobu 10-20 min s 1 ml/jamku roztoku obsahujícího 0,5 % Triton-X-100 a 20 mM glycin v PBS. Buňky infikované virem jsme imunobarvili inkubací po dobu 1 h s monoklonálními protilátkami specifickými pro nukleoprotein viru chřipky A (laskavě poskytnutými Dr. Alexandrem Klimovem z Centers for Disease Control, USA), následovanou 1 h inkubací s protilátkami proti myším značenými peroxidázou (DAKO, Dánsko) a 30 min inkubací s precipitačními substráty peroxidázy. Pro přípravu pracovních ředění imunoreagentů byl použit roztok 10% normálního koňského séra a 0,05% Tween-80 v PBS. Po aplikaci primárních a sekundárních protilátek jsme buňky promyli třikrát po dobu 3-5 min inkubací s 0,05% Tween-80 v PBS. Jako peroxidázové substráty jsme použili buď hotovou modř True Blue™ (KPL), nebo roztok aminoetylkarbazolu (AEC, Sigma) (0,4 mg/ml) připravený v 0,05 M octanu sodného, pH 5,5 a obsahující 0,03 % H2O2. Obarvené destičky byly promyty vodou z vodovodu, aby se reakce zastavila, a vysušeny. V případě barvení True Blue, které je ve vodných roztocích relativně nestabilní, byly destičky sušeny obráceně, aby se minimalizovalo bělení. Obarvené destičky byly naskenovány na plochém skeneru a data byla získána pomocí softwaru Adobe Photoshop 7.0.
Jako alternativu k imunobarvení jsme v některých experimentech odhalili plaky jako oblasti zničených buněk. Za tímto účelem jsme po odstranění překryvných vrstev obarvili buňky 1% roztokem krystalové violeti ve 20% metanolu ve vodě.
Varianty titrace viru v 96jamkových destičkách
1. Standardní varianta
Infikovali jsme monovrstvy buněk MDCK nebo MDCK-SIAT1 v 96jamkových destičkách 50 μl/jamku sériových ředění viru v udržovacím médiu bez trypsinu. Po 1 h inkubace při 35 °C v 5 % CO2 jsme virus odstranili, přidali 100 μl/jamku překryvného média MC nebo Avicel a inkubovali buňky dalších 24 h, aby se mohly tvořit plaky. Fixace a imunobarvení byly provedeny tak, jak je popsáno výše pro 6jamkové destičky, ale s použitím 50 μl činidel na jamku.
2. Zjednodušená varianta
Test byl proveden přesně jako ve standardní variantě s následujícími úpravami. Po 1 h inkubace s virem jsme neodstraňovali inokulum. Přidali jsme 100 μl/jamku překryvného média Avicel a promíchali destičku buď poklepáním rukou, nebo pomocí míchačky. Médium obsahovalo zvýšené množství trypsinu (1,5 μg/ml), aby se kompenzovalo ředění překryvu materiálem obsahujícím virus přítomným v jamkách.
Test inhibice plaku
Noel Roberts (Roche Products, UK) laskavě poskytl inhibitor neuraminidázy oseltamivir karboxylát (OC). Do monovrstev buněk MDCK-SIAT1 v 96jamkových destičkách jsme přidali 50 μl/jamku sériových desetinásobných ředění OC v udržovacím médiu bez trypsinu (rozmezí koncentrací od 4 nM do 400 μM OC). Poté jsme přidali 50 μl/jamku ředění viru (20-40 jednotek tvořících plaky na jamku). Destičky jsme promíchali a inkubovali 1 h při 35 °C, aby došlo k iniciaci virové infekce. Poté jsme přidali 100 μl/jamku 1,2% překryvného média Avicel obsahujícího 2 μg/ml trypsinu, inkubovali kultury po dobu 24 h a fixovali a imunobarvili je, jak je popsáno výše.
V případě 6jamkových destiček jsme přidali 0,75 ml alikvotů léčiva a inhibitoru a 1,5 ml alikvotu Avicelu na jamku a imunobarvili plaky 3 dny po infekci.