Nalezení účinného způsobu inhibice imunitní rejekce je jednou z nejdůležitějších strategií pro podporu klinických transplantací. Nedávné studie týkající se orgánových transplantací prokázaly, že aplikace inhibitoru DPPIV nebo anti-CD26 mAb zvýšila přihojení dárcovských buněk, respektive snížila akutní GVHD, a naznačily CD26 jako nový cíl pro terapeutický zásah u onemocnění GVHD.11 K objasnění úlohy CD26 při rejekci alogenního štěpu byly ve studii alogenní transplantace kůže použity CD26 knockoutované myši. Zjistili jsme, že CD26-/- myši vykazovaly nižší stupeň nekrózy štěpů a opožděnou rejekci alograftu (obr. 1).
CD26 je aktivační marker T a B lymfocytů a NK buněk. Jako kostimulační molekula zprostředkovává CD26 procesy přenosu signálu T-buňkami prostřednictvím interakce s adenosin deaminázou, CD45, caveolinem-1 nebo CARMA1.5 Blokáda ko-stimulace T-buněk zprostředkovaná CD26 vyvolala anergii CD4+ T-buněk.24 V této práci bylo v MPBL a MSL myší CD26-/- zjištěno nižší procento CD3+, stejně jako CD4+ buněk, a to jak před transplantací, tak po ní (obr. 3). Kromě toho byla infiltrace CD3+ a CD4+ buněk zjištěna v nižší míře ve tkáních štěpu CD26-/- myší než u CD26+/+ myší po transplantaci kůže (obr. 7b, c). Toto zjištění naznačuje, že nedostatek CD26 vede k poruše vývoje, zrání a funkce CD4+ buněk, což odpovídá našim předchozím zjištěním.23 Zajímavé je, že procento CD8+ buněk v MPBL myší CD26-/- bylo stejné jako u CD26+/+ myší před transplantací; po transplantaci kůže však bylo u CD26-/- výrazně nižší než u CD26+/+ myší (obr. 3). Počet infiltrovaných CD8+ buněk v kožních štěpech byl zřetelně nižší u CD26-/- než u CD26+/+ myší po transplantaci kůže. Tato zjištění naznačují sníženou proliferaci, aktivaci a funkci CD8+ buněk u CD26-/- myší v odpovědi na alogenní antigeny. CD8+ T-buňky jsou významnou složkou repertoáru alogenních T-buněk indukovaných po alogenní transplantaci u myší; jejich cytotoxická aktivita je zaměřena na peptidy I. třídy hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) dárce.25 Snížené procento CD8+ buněk u CD26-/- myší (obr. 3) po alogenní transplantaci může částečně přispívat ke sníženému stupni nekrózy štěpů a opožděné rejekci alograftu. Kromě toho bylo procento CD3+, CD4+ a CD4+NK1.1- buněk MSL u CD26-/- myší nižší než u CD26+/+ myší před transplantací, ale tento rozdíl se po transplantaci snížil. Bylo zjištěno, že inhibice CD26 zvýšila homing dárcovských buněk a zlepšila alogenní přihojení.26 Snížení procentuálního rozdílu CD3+ a CD4+ buněk MSL mezi oběma typy myší po transplantaci může být způsobeno zvýšeným homingem těchto buněk do sleziny u myší CD26-/-.
Odmítnutí alloštěpu je primárně řízeno T buňkami hostitele. Ačkoli se na rejekci štěpu podílejí všechny složky vrozeného i adaptivního imunitního systému, prvořadý význam v tomto procesu mají T lymfocyty a zejména CD4+ buňky.27 Po aktivaci řídí CD4+ T buňky především průběh odpovědi vylučováním cytokinů, které aktivují, rozšiřují a/nebo rekrutují další efektorové buňky, jako jsou makrofágy, CD8+ T buňky a B buňky.27 28 Další analýzou hladin cytokinů u obou typů myší byla v séru CD26-/- myší po alogenní transplantaci zjištěna výrazně snížená sekrece IL-2, IFN-γ, IL-6, IL-17, IL-4 a IL-13 (obr. 4). Tato snížená sekrece mohla být způsobena nižším počtem CD4+ buněk u CD26-/- myší před transplantací; je však třeba vzít v úvahu zhoršenou diferenciaci a funkci CD4+ buněk v odpovědi na alogenní antigen u CD26-/- myší. Nízké sérové hladiny IL-2, IFN-γ a IL-6 ukazují na částečně defektní diferenciaci a funkci Th1 buněk, zatímco nízké hladiny IL-4 a IL-13 ukazují na nedostatečnou diferenciaci a funkci Th2 buněk u CD26-/- myší.
Jako klíčový cytokin vykazuje IFN-γ rozmanité a potenciálně protichůdné účinky na rejekci orgánového alograftu.29 IL-2 je další cytokin spojený s Th1, který má rovněž komplexní účinky na rejekci alograftu.30 Jak IFN-γ, tak IL-2 jsou pleiotropní cytokiny a hrají důležitou roli v proliferaci T a B buněk během zánětlivé reakce. Tyto cytokiny nejprve působí jako molekuly iniciující růst a přežívání T-buněk během imunitní odpovědi a poté posilují Th1 odpověď pozitivní zpětnou vazbou.29, 30 Při akutní rejekci infiltrují do štěpů převážně Th1 buňky, u nichž mohou IL-2 a IFN-γ vyvolat aktivaci NK buněk a makrofágů, které jsou silnou zbraní pro zničení alograftu.29, 30 IFN-γ navíc indukuje expresi molekul MHC II. třídy a sekreci IgG2a a IgG3 z aktivovaných B buněk. V modelu akutní rejekce vykazovaly myši s IFN-γ-/- opožděnou rejekci kožního štěpu.31 Několik studií uvádí, že tolerance k rejekci alograftu je alespoň částečně zprostředkována IL-4, typickým cytokinem Th2 buněk, a to podporou IL-10 a produkce IgG1.32 Jiné studie poskytly rozporuplné výsledky, které naznačují, že podávání Th2 inhibitoru prodlužuje přežití srdečního alograftu.33 IL-13, který vykazuje podobné účinky jako IL-4, je dalším cytokinem spojeným s odpovědí Th2; IL-13 má s IL-4 společný receptorový řetězec (IL-4R α-řetězec), ale liší se v zapojených cílových buňkách, což vede k řadě odlišných biologických dějů.32 Stále více studií ukazuje, že cytokiny buněk Th1 i Th2, jako jsou IL-2, IFN-γ a IL-4, jsou schopny podporovat klonální expanzi B-buněk a syntézu protilátek.28, 34 Deficit CD26 vede u myší CD26-/- k poruše diferenciace a funkce buněk Th1 a Th2. Nízké hladiny Th1 cytokinů IFN-γ a IL-2 by mohly vést ke snížení proliferace CD8+ buněk (obr. 3) a aktivaci makrofágů, a tím ke snížení infiltrace CD8+ buněk a makrofágů do štěpů (obr. 7) během rejekce alograftu. Na druhou stranu nízké hladiny IFN-γ, IL-2 a IL-4 u CD26-/- myší po alogenní transplantaci mohly narušit aktivaci a diferenciaci B buněk a snížit produkci protilátek (obr. 2).
Imunitní rejekce je komplexní proces, který zahrnuje buněčnou i humorální imunitní odpověď a je charakterizován produkcí protilátek B lymfocyty. IgG, hlavní složka sérových Igs a běžná patogenní protilátka u pacientů s rejekcí transplantátu, hraje nezastupitelnou roli při poškozování štěpů během rejekce transplantátu.35 V naší současné práci byla v séru CD26-/- myší zjištěna nízká produkce IgG a jeho podskupin, IgG1 a IgG2a (obr. 2). Tento výsledek odpovídá našim předchozím zjištěním, která prokázala, že produkce protilátek byla u CD26-/- myší zřetelně nižší než u CD26+/+ myší buď po imunizaci ovalbuminem, nebo po stimulaci mitogenem pokeweed.23, 36 Toto zjištění naznačuje, že diferenciace B buněk byla narušena nedostatkem CD26. Při aktivaci B-buněk závislé na T-buňkách je k podpoře klonální expanze B-buněk a syntézy protilátek nutná interakce mezi B-buňkami a Th-buňkami a určitými cytokiny Th1 a Th2. U CD26-/- myší by nízké procento Th buněk (CD4+) (obr. 3) a nízká produkce IL-2 a IL-4 (obr. 4) mohly vést k poruše aktivace a diferenciace B buněk, a tím ke snížení produkce IgG. IgG je hlavní složkou, která zprostředkovává alorozpoznání mezi exogenními antigeny a CD8+ buňkami příjemce během rejekce štěpu.37 Nízká produkce IgG u CD26-/- myší (obr. 2) proto může vést ke snížení napadení štěpu efektorovými buňkami.
Zajímavé je, že hladina sekrece IL-10 byla vyšší u CD26-/- myší (obr. 4G). Na podporu našich výsledků bylo prokázáno, že blokáda CD26/DPPIV zlepšuje transplantaci plicního alograftu a zvyšuje expresi IL-10.38 IL-10 je známý jako protizánětlivý cytokin; uvádí se, že IL-10 snižuje expresi cytokinů Th1 a Th17 v procesu zánětu, zejména během signalizace Treg buněk.39 IL-10 produkují různé typy buněk, včetně Th2 a makrofágů a také regulačních T buněk.40 U myší CD26-/- mohly být vysoké hladiny sekrece IL-10 (obr. 4g) důsledkem vysokého procenta Treg (obr. 6). Pozoruhodné je, že v reakci na alogenní transplantaci byly v séru CD26+/+ myší zjištěny vysoké hladiny IL-6 od prvního dne a vrcholu dosáhly 7. den po transplantaci; v séru CD26-/- myší však bylo zjištěno pouze malé množství IL-6 až do 7. dne po transplantaci (obr. 4d). Nedávné studie prokázaly, že IL-6 hraje velmi důležitou roli v regulaci rovnováhy mezi Th17 buňkami produkujícími IL-17 a Tregs41. Nízká hladina IL-17 a vysoké procento Tregs pozorované u CD26-/- myší v této studii (obr. 5 a 6) tedy mohly být částečně způsobeny sníženou funkcí IL-6 a nadměrnou aktivitou IL-10.
Kromě toho bylo zjištěno, že lidské Th17 buňky se vyznačují vysokou expresí CD26,18 což je negativní selekční marker pro lidské Tregs,19 což naznačuje, že CD26 se podílí na diferenciaci a funkci Th17 buněk, ale nesouvisí s Tregs. Není proto překvapivé, že u myší s CD26-/- byla pozorována narušená rovnováha diferenciace Th17 a Tregs. Ačkoli odmítnutí alograftu je tradičně spojováno s diferenciací Th1, mnoho nedávných studií ukázalo, že s odmítnutím alograftu úzce souvisí buňky Th17 a IL-17.42 Buňky Th17 jsou novějším přírůstkem do paradigmatu T-buněk, zatímco IL-17, klíčový cytokin Th17, je prozánětlivý faktor.43 Hromadící se důkazy naznačují, že buňky Th17 hrají roli při vzniku chronického poškození alograftu při transplantaci různých orgánů. Charakteristickým znakem rejekce alograftu zprostředkované buňkami Th17 je schopnost IL-17 rekrutovat neutrofily, které jsou jedněmi z prvních zánětlivých efektorových buněk schopných infiltrovat alograft po transplantaci, a způsobit tak jeho poškození.42 Naopak Tregs hrají klíčovou roli v imunitní toleranci a negativní kontrole různých imunitních reakcí prostřednictvím potlačení nebo downregulace jiných efektorových T buněk během imunitní rejekce.44 Bylo zjištěno, že inhibice CD26/DPPIV podporuje sekreci TGF-β1, který je nezbytný pro diferenciaci Tregs.45 Pro vývoj a funkci CD4+CD25+ Treg buněk je nutný transkripční faktor forkhead (Foxp3).46 Uvádí se, že IL-10 je důležitým faktorem pro udržení exprese FoxP3.47 Vysoká hladina IL-10 pozorovaná u CD26-/- myší (obr. 4g) mohla prospět expresi FoxP3. Předpokládá se, že snížená aktivita Th17 a zvýšené procento Tregs v MSL a MPBL myší CD26-/- po alogenní transplantaci jsou nejdůležitějším důvodem snížené nekrózy štěpu a opožděné rejekce alograftu u myší CD26-/-.
Některé chemokiny přispívají k infiltraci makrofágů do tkání štěpu, například chemotaktické proteiny monocytů (MCP-1, -2, -3), faktor stimulující kolonie makrofágů (M-CSF nebo CSF-1) a chemokinový ligand 5 (CCL5 nebo RANTES (regulated and normal T cell expressed and secreted)).48 Jako substráty DPPIV/CD26 mohou být MCP a RANTES zkráceny DPPIV, což vede ke změně jejich chemotaktických vlastností.3 Bylo zjištěno, že MCP s amino-terminálním Lys může být štěpen CD26/DPPIV a může dojít k inaktivaci jeho chemotaxe; MCP s NH2-terminálním pGlu však zůstal neovlivněn.49 Vliv CD26 na různé izoformy MCP podílející se na chemotaxi makrofágů během transplantace kůže by měl být dále zkoumán. Bylo zjištěno, že zkrácení CCL5/RANTES pomocí DPPIV snižuje jeho vazbu na chemokinový receptor 1 (CCR1) a CCR3, ale zvyšuje jeho vazbu na CCR5, což přispívá k náboru makrofágů v renálních štěpech.48 Deficit CD26 u myší CD26-/- pravděpodobně snížil aktivitu vazby CCL5/RANTES na CCR5 a vedl ke snížení infiltrace makrofágů do štěpů.
CD26 je multifunkční protein, který vykazuje buď enzymatickou aktivitu, nebo interaguje s různými molekulami. Nedávné studie uvádějí, že CD26/DPPIV se podílí na hojení kožních ran. U myší s CD26-/- byla pozorována vyšší míra uzavření rány, revaskularizace a proliferace buněk a inhibitor DPPIV prokázal potenciální přínos při hojení rány.50 V případě transplantace kůže se CD26 podílí nejen na imunitní rejekci, ale také na procesu hojení rány; CD26 tedy hraje roli podobnou Janusově při přihojování a rejekci. V této práci byla úroveň nekrózy ve štěpech a hladiny IgG a souvisejících cytokinů v séru myší CD26-/- výrazně nižší než u myší CD26+/+. Od 13. dne po transplantaci však byly štěpy odstraněny a rány se u myší CD26-/- rychle hojily. Snížení rejekce alogenního štěpu u CD26-/- myší, jak bylo pozorováno v naší současné práci, může být částečně kompenzováno zlepšením hojení ran, kde se CD26 podílí na obou procesech.
Závěrem naše výsledky naznačují, že CD26 se podílí na rejekci alogenního štěpu. Deficit CD26 vedl k částečně narušené diferenciaci subpopulací Th1, Th2 a Th17, ale zvýšil procento Tregs. Snížená funkce Th1, Th2 a Th17 zase ovlivnila diferenciaci B buněk a snížila aktivitu CD8+ buněk a makrofágů, což vedlo k nižší produkci IgG a opožděné rejekci alograftu u CD26-/- myší.
.