Enzymatický převod mRNA na dvouvláknovou vloženou DNA lze provést několika různými postupy. Všechny zahrnují působení reverzní transkriptázy a syntézu cDNA s použitím oligonukleotidů. Poté se běžně používané postupy značně liší. Existuje řada metod pro syntézu druhého vlákna a několik postupů pro vytvoření vhodných konců pro tvorbu klonovatelné DNA. Hlavním cílem těchto postupů je zkonstruovat co nejdelší vloženou DNA s vysokou výtěžností přeměny mRNA na DNA, která se může ligátovat s vektorovou DNA. Následující protokoly vyžadují pouze komerčně dostupná činidla a obvykle úspěšně vytvářejí dobré knihovny cDNA. Základní protokol popisuje metodu výroby cDNA s tupým koncem, kterou lze následně navázat na linkery pro následné klonování do jedinečného restrikčního místa, jako je EcoRI. Alternativní protokol je variantou, která vyžaduje méně enzymatických manipulací a umožňuje konstrukci směrových knihoven cDNA, které jsou zvláště žádoucí, pokud je cílem vytvořit expresní knihovny cDNA. Alternativní protokol využívá výhodu linker-primeru, který se skládá (v pořadí od 3′ do 5′) z oligo(dT) primeru, restrikčního místa pro endonukleázu XhoI a opakování (GA)20 k ochraně restrikčního místa během generování cDNA s rozostřeným koncem. Vnitřní místa XhoI na jednotlivých molekulách cDNA jsou chráněna začleněním 5-methyl-dCTP do směsi nukleotidů prvního řetězce. Výsledné cDNA s jedinečnými konci lze klonovat do EcoRI /XhoI -digestovaných vektorů po ligování EcoRI adaptérů na 5′ konec a štěpení XhoI, aby se uvolnila 3′ místa XhoI, která byla do cDNA začleněna linkerem-primerem. Tyto změny vedly ke značně zjednodušenému postupu, který je podstatně rychlejší a jednodušší než základní protokol
.