Practice for Human Genetics Vienna

Vyhledávání mikroaberací v celém genomu: Array-CGH

Komplexní syndromy založené na zmnožení nebo redukci chromozomálního materiálu jsou známy již dlouho. Například u trizomie 21 je kompletní chromozom přítomen třikrát místo dvakrát. U mikrodelečních syndromů, jako je Williams-Beurenův, Prader-Williho nebo Smith-Magenisův syndrom, chybí více či méně definované úseky chromozomů, obvykle v submikroskopickém měřítku několika megabází. V případě monogenetických onemocnění se v poslední době stále častěji objevují jako příčina onemocnění delece nebo duplikace jednotlivých genů nebo genových segmentů.

Dosud používané techniky diagnostiky těchto změn v dávkování genů mají svá omezení: Například molekulárně cytogenetické metody, jako je FISH, nebo molekulárně genetické metody, jako je MLPA, sice mohou být použity s vysokým nebo nejvyšším rozlišením, ale musí a priori vědět nebo předpokládat, která oblast genomu je postižena. Na druhé straně klasická cytogenetika nebo technika CGH („komparativní genomová hybridizace“: Srovnávací hybridizace pacientské a referenční DNA na metafázních chromozomech) může pokrýt celý genom, ale rozlišení je kvůli použití světelného mikroskopu omezeno v nejlepším případě na přibližně 5 Mb.

Pro překonání těchto omezení stávajících technik je vhodnou alternativou array CGH.

Konvenční technika CGH je zde kombinována se zkušenostmi získanými při analýze exprese pomocí microarrays: Definované fragmenty DNA imobilizované na povrchu skleněného sklíčka slouží jako hybridizační cíle, přičemž termín „array“ odkazuje na pravidelné, mřížkovité uspořádání těchto fragmentů. Fragmenty jsou vybrány tak, aby co nejrovnoměrněji pokrývaly lidský genom.

Pro analýzu se na matrici kohybridizuje přibližně stejné množství DNA pacienta a referenční genomové DNA. Vzhledem k tomu, že pacientské a referenční vzorky DNA jsou označeny různými fluorescenčními barvivy, vede číselná změna v genomu pacienta k barevnému posunu fluorescenčního signálu jednotlivých fragmentů prostřednictvím posunu hybridizačního poměru.

Schematické znázornění techniky array CGH:

ve skeneru detekuje fluorescenční signály a registruje barevné posuny. Pomocí vhodného softwaru se signály přiřadí k oblasti genu a nakonec lze výsledek zobrazit např. jako „karyogram“, který ukazuje, na kterém místě chromozomu jsou změny přítomny.

Zobrazení výsledku array CGH: duplikace oblasti Xp11-p21.1 (vytvořeno v ZMG pomocí CGHAnalytics, Agilent)

Počet a hustota fragmentů na array určuje rozlišení array CGH. V současné době jsou k dispozici matrice s pokrytím celého lidského genomu s rozlišením od 1 Mb do přibližně 35 kb. Vzhledem k neustále se zvyšujícímu počtu fragmentů na poli se bude rozlišení nadále zvyšovat. Tak lze spolehlivě odhalit nerovnováhu jednotlivých genů.

Použití array CGH

Array CGH je tedy technika, při které lze s vysokým rozlišením vyšetřit kompletní genom pacienta na odchylky od normálního dávkování genů. Stále většího významu nabývá jako inovativní screeningová metoda, ačkoli byla nejprve využívána především v diagnostice nádorů. Je to proto, že progrese nádoru je charakterizována hromaděním aberací, které mohou být doprovázeny amplifikací onkogenů a delecí tumor supresorových genů.

ArrayCGH má zvláštní význam pro diagnostiku případů nevysvětlitelné mentální retardace. Při standardní cytogenetice jsou aberace viditelné asi v 5 % případů u pacientů s mentální retardací a dalšími známkami dysmorfie nebo familiárního shlukování. Subtelomerový screening pomocí FISH nebo MLPA může najít příčinu v dalších 5 % případů. Nedávné studie ukazují, že array CGH s rozlišením přibližně 1 Mb odhalí genomové nerovnováhy u 10-15 % pacientů s nenápadným karyotypem a negativním nálezem subtelomer. (viz literatura). Předpokládá se, že s rostoucím rozlišením polí se bude tato míra detekce zvyšovat. Některé výzkumné skupiny již doporučují array CH jako první diagnostický krok v případech nevysvětlitelné mentální retardace.

Nicméně array CH nejen detekuje nové dysbalance, ale může být také použita k přesnému určení velikosti delece, umístění zlomových bodů nebo původu dodatečného materiálu v případech cytogeneticky viditelné ztráty nebo zisku chromozomálních oblastí. To je důležité pro přesnou korelaci genotyp-fenotyp a pro identifikaci kandidátních genů, které se podílejí na vzniku MR a dysmorfie. U některých chromozomálních abnormalit, které byly dříve považovány za „vyvážené“ translokace, se pomocí array CGH podařilo prokázat, že genetický materiál je v oblasti zlomových bodů odstraněn nebo duplikován, a jedná se tedy o nebalancovanou translokaci. Pomocí array CGH se tedy cytogenetické nálezy zpřesňují a korigují.

Ačkoli se tedy hranice mezi cytogenetikou a molekulární genetikou stále více stírají, karyotypizace zůstává důležitá, protože některé chromozomální změny nejsou pomocí array CGH detekovatelné: Polyploidie, skutečné vyvážené translokace a mozaikové stavy s malým podílem aberantních buněk.

Vzhledem k vysoké míře detekce celého genomu a skutečnosti, že není nutná časově a pracovně náročná kultivace buněk, otevírá array CGH nové možnosti prenatální diagnostiky.

Při všech výhodách a možnostech této průkopnické techniky bychom však neměli zapomínat, že skok od výzkumu k diagnostice se zde teprve odehrává. Proto array CGH nejen objasňuje otevřené otázky, ale interpretace výsledků může přinést i nové otázky:

Studiemi array CGH bylo zjištěno, že lidský genom obsahuje nečekaně vysoký podíl oblastí, jejichž počet kopií se u fenotypově normálních lidí mění (viz literatura). Velikost těchto CNV („copy number variations“) se pohybuje od několika kilobází až po několik megabází. Odhaduje se, že každý jedinec je nositelem nejméně 3-11 takových variant. Databáze uvádějící takové polymorfismy (tj. mutace, které zjevně neovlivňují fenotyp) teprve vznikají, a proto jsou stále neúplné. Pokud jsou nyní v DNA pacienta pomocí array CGH nalezeny aberace, často se spekuluje, zda jsou vůbec zodpovědné za fenotyp. Ve většině případů je nutné vyšetřit také DNA rodičů.

Pravděpodobnost, že chromozomální aberace je příčinou onemocnění, se zvyšuje

• s velikostí aberace
• , pokud je přítomna „de novo“, rodiče tuto aberaci nenesou
• pokud není uvedena v žádné databázi polymorfismů
• pokud jsou postiženy geny, které lze spojit s pozorovaným fenotypem
• pokud jsou známy případy se stejnou nebo podobnou aberací, které vykazují podobný fenotyp.

Čím více se bude array CGH používat v klinické diagnostice, tím spíše se design array přizpůsobí požadavkům této oblasti: Tím, že se vyhýbají známým CNV oblastem a upřednostňují chromozomální oblasti a geny, které se podílejí na mentální retardaci a dysmorfických syndromech, budou matrice stále zajímavější pro prenatální a postnatální diagnostiku.

Náš ústav nastavil kurz tak, abychom mohli využít výhod technologie matric již nyní a abychom byli schopni okamžitě zachytit budoucí vývoj. Rozhodli jsme se pro technické vybavení, které dokáže spolehlivě a reprodukovatelně vyhodnotit i pole s nejvyšším rozlišením.

Chcete-li využít našich služeb a zkušeností v oblasti array CGH, kontaktujte nás. Rádi vás budeme informovat o době trvání takového šetření, nákladech a designech matic, které lze v současné době použít.

Reference

Array CGH in mental retardation

Shaw-Smith C, Redon R, Rickman L, Rio M, Willatt L, Fiegler H, Firth H, Sanlaville D, Winter R, Colleaux L, Bobrow M, Carter NP. Komparativní genomová hybridizace na bázi mikročipů (array-CGH) detekuje submikroskopické chromozomální delece a duplikace u pacientů s poruchou učení/mentální retardací a dysmorfickými rysy. J Med Genet. 2004 Apr;41(4):241-8.

de Vries BB, Pfundt R, Leisink M, Koolen DA, Vissers LE, Janssen IM, Reijmersdal S, Nillesen WM, Huys EH, Leeuw N, Smeets D, Sistermans EA, Feuth T, van Ravenswaaij-Arts CM, van Kessel AG, Schoenmakers EF, Brunner HG, Veltman JA. Diagnostické profilování genomu u mentální retardace. Am J Hum Genet. 2005 Oct;77(4):606-16.

Menten B, Maas N, Thienpont B, Buysse K, Vandesompele J, Melotte C, de Ravel T, Van Vooren S, Balikova I, Backx L, Janssens S, De Paepe A, De Moor B, Moreau Y, Marynen P, Fryns JP, Mortier G, Devriendt K, Speleman F, Vermeesch JR. Nové vzorce kryptických chromozomálních nerovnováh u pacientů s idiopatickou mentální retardací a mnohočetnými vrozenými vadami: nová série 140 pacientů a přehled literatury. J Med Genet. 2006.

Array-CGH in der Pränataldiagnostik

Rickman L, Fiegler H, Shaw-Smith C, Nash R, Cirigliano V, Voglino G, Ng BL, Scott C, Whittaker J, Adinolfi M, Carter NP, Bobrow M. Prenatal detection of unbalanced chromosomal rearrangements by array-CGH. J Med Genet. 2006 Apr;43(4):353-61.

Van den Veyver, IB; Beaudet AL. Comparative genomic hybridization and prenatal diagnosis [Komparativní genomová hybridizace a prenatální diagnostika]. Curr Opin Obstet Gynecol 2006 (18): 185-191.

Die Bedeutung der CNVs (copy number variations) für die Array-CGH

Feuk L, Carson AR, Scherer SW. Strukturní variace v lidském genomu. Nat Rev Genet. 2006 Feb;7(2):85-97

.