Sekvenování a genetická charakterizace genomu viru chřipky

Sekvenování genomu

Chřipkové viry se neustále mění, ve skutečnosti všechny chřipkové viry procházejí v průběhu času genetickými změnami (více informací naleznete v článku Jak se může měnit virus chřipky: „Drift“ a „Shift“). Genom chřipkového viru se skládá ze všech genů, které tvoří virus. CDC provádí celoroční sledování cirkulujících chřipkových virů s cílem monitorovat změny genomu (nebo jeho částí) těchto virů. Tato práce se provádí v rámci rutinního sledování chřipky v USA a v rámci role CDC jako spolupracujícího centra Světové zdravotnické organizace (WHO) pro referenční a výzkum chřipky. Informace, které CDC shromažďuje při studiu genetických změn (známých také jako „substituce“, „varianty“ nebo „mutace“) v chřipkových virech, hrají důležitou roli v oblasti veřejného zdraví, protože pomáhají určit, zda vakcíny a antivirotika budou fungovat proti aktuálně cirkulujícím chřipkovým virům, a také pomáhají určit potenciál chřipkových virů u zvířat nakazit člověka.

Sekvenování genomu odhaluje pořadí nukleotidů v genu, podobně jako písmena abecedy ve slovech. Nukleotidy jsou organické molekuly, které tvoří stavební jednotku nukleových kyselin, jako je RNA nebo DNA. Všechny chřipkové viry se skládají z jednořetězcové RNA na rozdíl od dvouřetězcové DNA. Geny RNA chřipkových virů jsou tvořeny řetězci nukleotidů, které jsou navzájem spojeny a kódovány písmeny A, C, G a U, což znamená adenin, cytosin, guanin a uracil. Porovnáním složení nukleotidů v genu jednoho viru s pořadím nukleotidů v genu jiného viru lze odhalit rozdíly mezi oběma viry.

Genetické rozdíly jsou důležité, protože mohou ovlivnit strukturu povrchových proteinů chřipkového viru. Proteiny se skládají ze sekvencí aminokyselin.

Záměna jedné aminokyseliny za jinou může ovlivnit vlastnosti viru, například to, jak dobře se virus přenáší mezi lidmi a jak je virus citlivý na antivirotika nebo současné vakcíny.

Viry chřipky A a B – primární chřipkové viry, které infikují lidi – jsou RNA viry, které mají osm genových segmentů. Tyto geny obsahují „instrukce“ pro tvorbu nových virů a právě tyto instrukce chřipkový virus použije, jakmile infikuje lidskou buňku, aby ji přiměl k produkci dalších chřipkových virů, a tím k šíření infekce.

Chřipkové geny se skládají ze sekvence molekul zvaných nukleotidy, které se spojují do řetězce. Nukleotidy se označují písmeny A, C, G a U.

Sekvenování genomu je proces, který určuje pořadí neboli sekvenci nukleotidů (tj. A, C, G a U) v každém z genů přítomných v genomu viru. Sekvenování celého genomu může odhalit přibližně 13 500 písmen sekvence všech genů genomu viru.

Každoročně provádí CDC sekvenování celého genomu přibližně 7 000 chřipkových virů z původních klinických vzorků odebraných v rámci virologického sledování. Genom viru chřipky A nebo B obsahuje osm genových segmentů, které kódují (tj. určují strukturu a vlastnosti) 12 proteinů viru, včetně jeho dvou hlavních povrchových proteinů: hemaglutininu (HA) a neuraminidázy (NA). Povrchové proteiny chřipkového viru určují důležité vlastnosti viru, včetně toho, jak virus reaguje na určitá antivirotika, genetické podobnosti viru se současnými viry chřipkové vakcíny a potenciálu zoonotických (zvířecího původu) chřipkových virů infikovat lidské hostitele.

Genetická charakterizace

CDC a další laboratoře veřejného zdraví po celém světě sekvenují geny chřipkových virů od 80. let 20. století. CDC přispívá sekvencemi genů do veřejných databází, jako je GenBankexterní ikona a Globální iniciativa pro sdílení dat o ptačí chřipce (GISAID)externí ikona, pro použití výzkumníky v oblasti veřejného zdraví. Výsledné knihovny genových sekvencí umožňují CDC a dalším laboratořím porovnávat geny v současnosti cirkulujících chřipkových virů s geny starších chřipkových virů a virů používaných ve vakcínách. Tento proces porovnávání genetických sekvencí se nazývá genetická charakterizace. CDC používá genetickou charakterizaci z následujících důvodů:

• K určení, jak blízce „příbuzné“ nebo podobné jsou si chřipkové viry po genetické stránce
• K monitorování toho, jak se chřipkové viry vyvíjejí
• K identifikaci genetických změn, které ovlivňují vlastnosti viru. Například identifikovat specifické změny, které jsou spojeny s tím, že se chřipkové viry snadněji šíří, způsobují závažnější onemocnění nebo vyvíjejí rezistenci vůči antivirotikům
• Vyhodnotit, jak dobře by vakcína proti chřipce mohla chránit proti určitému chřipkovému viru na základě jeho genetické podobnosti s tímto virem
• Sledovat genetické změny chřipkových virů cirkulujících v populacích zvířat, které by jim mohly umožnit infikovat člověka.

Relativní rozdíly mezi skupinou chřipkových virů se zobrazují jejich uspořádáním do grafu zvaného „fylogenetický strom“. Fylogenetické stromy chřipkových virů jsou jako rodokmeny (genealogie) lidí. Tyto stromy ukazují, jak blízce jsou si jednotlivé viry „příbuzné“. Viry jsou seskupeny podle toho, zda jsou nukleotidy jejich genů identické, nebo ne. Fylogenetické stromy chřipkových virů obvykle zobrazují, jak podobné jsou si geny hemaglutininu (HA) nebo neuraminidázy (NA) jednotlivých virů. Každá sekvence z konkrétního chřipkového viru má na stromu svou vlastní větev. Míru genetické odlišnosti (počet nukleotidových rozdílů) mezi viry představuje délka vodorovných čar (větví) ve fylogenetickém stromu. Čím dále jsou viry od sebe na vodorovné ose fylogenetického stromu, tím více se od sebe geneticky liší.

Například poté, co CDC sekvenuje virus chřipky A(H3N2) získaný v rámci dozoru, je sekvence viru katalogizována s dalšími sekvencemi virů, které mají podobný gen HA (H3) a podobný gen NA (N2). V rámci tohoto procesu CDC porovnává novou sekvenci viru s ostatními sekvencemi virů a hledá mezi nimi rozdíly. CDC pak používá fylogenetický strom, který vizuálně znázorňuje, jak se od sebe viry A(H3N2) geneticky liší.

CDC provádí genetickou charakterizaci chřipkových virů po celý rok. Tyto genetické údaje se používají ve spojení s údaji o antigenní charakterizaci virů, aby pomohly určit, které vakcinační viry by měly být vybrány pro nadcházející vakcíny proti chřipce na severní polokouli nebo na jižní polokouli. V měsících před konzultačními schůzkami WHO o vakcínách, které se konají v únoru a září, shromažďuje CDC chřipkové viry prostřednictvím sledování a porovnává sekvence genů HA a NA současných vakcinačních virů se sekvencemi cirkulujících chřipkových virů. To je jeden ze způsobů, jak posoudit, jak úzce jsou cirkulující chřipkové viry příbuzné virům, proti kterým byla sezónní chřipková vakcína vytvořena. Jakmile jsou viry shromážděny a geneticky charakterizovány, mohou být odhaleny rozdíly.

Například někdy se v průběhu sezóny cirkulující viry geneticky změní, což způsobí, že se začnou lišit od příslušného vakcinačního viru. To je jedna z indicií, že pro vakcínu příští chřipkové sezóny může být nutné vybrat jiný vakcinační virus, ačkoli rozhodnutí o vakcíně silně ovlivňují i další faktory, včetně nálezů antigenní charakterizace. Povrchové proteiny HA a NA chřipkových virů jsou antigeny, což znamená, že jsou rozpoznávány imunitním systémem a jsou schopny vyvolat imunitní odpověď, včetně tvorby protilátek, které mohou zablokovat infekci. Antigenní charakterizace se týká analýzy reakce viru s protilátkami, která pomáhá posoudit, jaký je jeho vztah k jinému viru.

Metody sekvenování genomu chřipky

Tradičně vědci používají ke sledování vývoje chřipky v rámci virologického dohledu techniku sekvenování zvanou „Sangerova reakce“. Sangerovo sekvenování identifikuje převládající genetickou sekvenci mezi mnoha chřipkovými viry nalezenými v izolátu. To znamená, že malé odchylky v populaci virů přítomných ve vzorku se v konečném výsledku neprojeví. Vědci často používají Sangerovu metodu k částečnému sekvenování genomu chřipkových virů, zatímco novější technologie (viz následující odstavec) jsou vhodnější pro sekvenování celého genomu.

V posledních pěti letech používá CDC metodiku „sekvenování nové generace (NGS)“, která výrazně rozšířila množství informací a detailů, které může sekvenační analýza poskytnout. NGS využívá pokročilou molekulární detekci (AMD) k identifikaci genových sekvencí jednotlivých virů ve vzorku. NGS tedy odhaluje genetické rozdíly mezi mnoha různými částicemi chřipkového viru v jednom vzorku a tyto metody také odhalují celou kódující oblast genomů. Tato úroveň detailů může být důležitým způsobem přímo přínosná pro rozhodování v oblasti veřejného zdraví, údaje však musí být pečlivě interpretovány vysoce kvalifikovanými odborníky v kontextu dalších dostupných informací. Viz projekty AMD: Více informací o tom, jak NGS a AMD přinášejí revoluci v mapování chřipkového genomu v CDC, naleznete v kapitole Projekty pro zlepšení chřipkových vakcín

.