Překvapivý objev nové dráhy řízené signálním proteinem Notch otevírá dveře k lepšímu vývoji léků
Od Lindsay Brownellové
(BOSTON) – Každou minutu pulzuje sítí žil a tepen v těle litr a půl krve. Síla tohoto krevního toku pomáhá udržovat zdravé buňky, které vystýlají cévy, zvané endotelové buňky; když je tok krve narušen, například při chirurgickém zákroku nebo mrtvici, cévy začnou unikat, což může způsobit řadu zánětlivých reakcí, které vedou k poškození buněk a onemocnění. Vědci z Wyssova institutu na Harvardově univerzitě se rozhodli vyřešit záhadu, jak průtok krve udržuje cévy neporušené, a ke svému překvapení objevili zcela novou buněčnou signální dráhu, která je slibným cílem pro léky k léčbě různých oslabujících stavů.
„Zjistili jsme, že dobře známý protein Notch je zodpovědný za to, že krevní cévy netěsní, a to prostřednictvím sekundární signální dráhy, která funguje zcela jiným způsobem než jeho známá dráha založená na transkripci,“ říká Chris Chen, M.D., Ph.D., přidružený člen fakulty Wyss Institute a zakládající ředitel Biological Design Center a významný profesor biomedicínského inženýrství na Boston University, který je odpovídajícím autorem článku. „Tato nová cesta je vzrušující nejen z hlediska objevů, ale mohla by také zmírnit některé vedlejší účinky léků proti rakovině a kardiovaskulárním chorobám a učinit je tak bezpečnějšími a účinnějšími.“ Studie byla dnes publikována v časopise Nature.
Endotelové buňky, které lemují cévy, jsou pevně spojeny dohromady pomocí spojů zvaných adherenční spoje a vytvářejí bariéru, která udržuje krev uvnitř cévy a reguluje, jak snadno do ní mohou procházet další látky a jak z ní mohou odcházet. Aby mohli tuto bariéru studovat a zjistit, proč nedostatek průtoku krve způsobuje její netěsnost, vytvořili vědci model cévy na čipu sestávající z kanálu vystlaného vrstvou lidských endotelových buněk obklopených extracelulární matrix v mikrofluidním zařízení, což jim umožnilo snadno simulovat a kontrolovat průtok krve cévou a vyhodnocovat reakce buněk.
Endotelové buňky, které zažily průtok krve, vykazovaly zvýšenou aktivitu transmembránového proteinu Notch1, zatímco buňky vystavené statické krvi nikoli. Když vědci přidali chemickou látku, která blokuje aktivaci Notch1 tím, že brání odpojení jeho intracelulární domény, pozorovali, že céva začala prosakovat, což určili jako příčinu narušení adherenčních spojů mezi sousedními endotelovými buňkami a reorganizace aktinových vláken uvnitř každé buňky. To potvrdilo, že aktivace Notch1 průtokem krve je nezbytná pro vytvoření a udržení endoteliální bariéry cév.
Zajímavé je, že zabránění intracelulární doméně Notch1 v zahájení transkripce po odpojení (což je dobře známý mechanismus působení Notch1) nezpůsobilo, že by cévy netekly, což znamená, že na průtok krve reagovala nějaká jiná část proteinu, jejíž funkce nezahrnuje transkripci. Toto podezření posílily experimenty in vivo, při nichž vědci aplikovali myším chemickou látku blokující Notch1 spolu s modrým barvivem a zjistili, že barvivo uniká z cév léčených myší mnohem rychleji, než se očekávalo. „Přepis genu do proteinu, který pak v buňce vykonává nějakou funkci, trvá obvykle asi dvě hodiny, ale my jsme pozorovali únik během 30 minut, což dále naznačuje, že jakýkoli proces, který řídí propustnost bariéry, funguje prostřednictvím zcela jiného mechanismu,“ říká doktor Bill Polacheck, Poté, co vědci zjistili, že se vnitrobuněčná doména nepodílí na regulaci endoteliální bariéry, prověřili aktivitu dalších částí Notch1. Pomocí CRISPR/Cas-9 odstranili různé části genu Notch1 a zjistili, že odstranění části, která kóduje intracelulární doménu, nemělo na propustnost žádný vliv, zatímco odstranění části s malou transmembránovou doménou (TMD) stejně jako odstranění části s intracelulární doménou způsobilo zvýšení úniku z cév za podmínek průtoku. „Je to vůbec poprvé, co byla vyhodnocena biologická funkce TMD Notch,“ říká doktor Matthew Kutys, hostující vědecký pracovník Wyssova institutu a spoluautor prvního článku. „Z velké části se předpokládalo, že je inertní a po aktivaci prostě jakoby zmizí, a většina učebnic a výzkumných prací ji ani neuvádí jako samostatnou část receptorů Notch.“ Dalším testováním přišli na to, že když je Notch1 aktivován a jeho intracelulární doména je uvolněna, jeho TMD sestaví v membráně komplex s proteiny VE-cadherin, Rac1, LAR a Trio, které společně sestavují a udržují adherenční spoje mezi buňkami a rozvádějí aktinová vlákna proti buněčné membráně, aby tyto spoje podpořily.
„Při zpětném pohledu na tento projekt jsme si hodili kostkou, protože tím, že jsme se rozhodli zkoumat Notch, jsme vstupovali do jedné z nejvíce přeplněných oblastí výzkumu v biologii. Náš inženýrský přístup nám však umožnil studovat ji novým způsobem, bez vlivu a předpojatosti předchozích prací, což si myslím, že nám umožnilo být dostatečně otevření a pozorovat a charakterizovat tuto novou, nečekanou dráhu,“ říká Polacheck. „Poznání, že Notch1 reguluje kromě diferenciace buněk také buněčnou adhezi, nabízí nový rámec pro pochopení koordinace složitých buněčných procesů v tom smyslu, že jednotlivé molekuly, jako je Notch, mohou hrát více rolí,“ dodává Kutys.
Odhalení, že Notch1 plní různé funkce, a znalost toho, které části proteinu řídí jednotlivé funkce, umožňuje vývoj nových léků, které jsou účinnější a méně toxické. „Notch je cílem některých terapií rakoviny, ale tyto léky jsou známé tím, že způsobují otoky a další problémy. Nyní aktivně pracujeme na oddělení dvou drah Notche, abychom mohli vytvořit léky, které budou cílit pouze na intracelulární doménu, ušetří TMD a zachovají tak integritu cév,“ říká doktorka Karen Hirschiová, profesorka medicíny a genetiky na Yale School of Medicine, která na studii spolupracovala. Vědět, že Notch řídí propustnost cév, z něj dělá kandidáta na nové léky k léčbě kardiovaskulárních onemocnění a tým také zkoumá TMD jako potenciální terapeutický prostředek, protože buněčné modely, které byly vystaveny zánětu vyvolávajícímu únik, vykazovaly dramatické snížení úniku, když byly upraveny tak, aby exprimovaly TMD.
„Spolupráce, kterou Wyssův institut umožňuje a rozvíjí mezi různými obory, jako je strojírenství a molekulární biologie, podporuje nové přístupy ke starým problémům, které mohou vést ke skutečně paradigmatickým výsledkům,“ říká doktor Donald Ingber, zakládající ředitel Wyssova institutu a profesor cévní biologie Judah Folkman na Harvard Medical School a programu cévní biologie v Bostonské dětské nemocnici, který je rovněž profesorem bioinženýrství na Harvard Paulson School of Engineering and Applied Sciences (SEAS). „Tato studie je ukázkovým příkladem toho, jaký přínos mohou tyto typy partnerství přinést vědě a společnosti.“
Dalšími autory studie jsou doktor Jinling Yang, postdoktorand na Wyssově institutu; Jeroen Eyckmans, Ph, bývalý postdoktorand Wyssova institutu a současný vedoucí skupiny na Bostonské univerzitě; Yinyu Wu, postgraduální student na katedře genetiky na Yaleově univerzitě; a Hema Vasavada, vedoucí laboratoře na Yaleově lékařské fakultě.
Tento výzkum byl podpořen granty Národního ústavu zdraví (NIH), Národní vědecké nadace (NSF), cenou Ruth L. Kirchstein National Research Service Award, The Hartwell Foundation a Wyssova institutu na Harvardově univerzitě.
- PUBLIKACE – Nature: Nekanonický komplex Notch reguluje adherenční spoje a funkci cévní bariéry
.