Vnější versus vnitřní cesty apoptózy v protinádorové chemoterapii

Signalizace prostřednictvím vnitřní cesty apoptózy

V mitochondriální cestě apoptózy, aktivace kaspáz úzce souvisí s permeabilizací vnější mitochondriální membrány proapoptotickými členy rodiny Bcl (Green a Kroemer, 2004). Četné cytotoxické podněty a molekuly přenášející proapoptotické signály se sbíhají v mitochondriích a vyvolávají permeabilizaci vnější mitochondriální membrány (Decaudin et al., 1998; Green a Kroemer, 2004). Tato permeabilizace je regulována proteiny z rodiny Bcl-2, mitochondriálními lipidy, proteiny regulujícími bioenergetický tok metabolitů a složkami permeabilitního přechodového póru (Green a Kroemer, 2004). Při narušení vnější mitochondriální membrány se uvolní soubor proteinů, které se obvykle nacházejí v prostoru mezi vnitřní a vnější mitochondriální membránou, včetně cytochromu c, Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, AIF a endonukleázy G (Saelens a kol., 2004). Jakmile se tyto apoptogenní proteiny dostanou do cytosolu, spustí provedení buněčné smrti tím, že podporují aktivaci kaspáz nebo působí jako na kaspázách nezávislé smrtící efektory (Saelens et al.,

Mitochondriální mediátory apoptózy závislé na kaspáze

Cytochrom c

Uvolnění cytochromu c z mitochondrií přímo spouští aktivaci kaspázy-3 prostřednictvím tvorby apoptózového komplexu obsahujícího cytochrom c/Apaf-1/kaspázu-9 (Cain et al., 2000). Jakmile se cytochrom c dostane do cytosolu, váže se na C-koncovou oblast Apaf-1, cytosolického proteinu s N-koncovou kaspase-recruitment doménou (CARD), nukleotidovou vazebnou doménou s homologií k Caenorhabditis elegans CED-4 a C-koncovou doménou obsahující 12-13 opakování WD-40 (Zou et al., 1997). Vazba cytochromu c na Apaf-1 usnadňuje asociaci dATP s Apaf-1 a obnažuje jeho N-terminální CARD, který se nyní může oligomerizovat a stát se platformou, na níž se rekrutuje a aktivuje iniciátorová kaspáza-9 prostřednictvím interakce CARD-CARD (Adrain et al., 1999). Následně je katetrizační kaspáza-3 rekrutována do apoptosomu, kde je aktivována rezidentní kaspázou-9 (Bratton et al., 2001). Kaspáza-3 pak štěpí klíčové substráty v buňce, čímž dochází k mnoha buněčným a biochemickým dějům apoptózy.

V některých případech přispívá aktivita kaspázy podnícená cytosolickým cytochromem c k poklesu matrixové metaloproteinázy (MMP), jak bylo prokázáno použitím syntetických inhibitorů kaspázy a buněk Apaf1 -/- (Waterhouse et al., 2001). Aktivita kaspáz navíc dále poškozuje funkci permeabilizovaných mitochondrií ovlivněním aktivity komplexů I a II, což nevyhnutelně vede k úbytku MMP a tvorbě reaktivních forem kyslíku (Ricci et al., 2004). Sekundární děje vyplývající z cytosolických změn způsobených uvolněním cytochromu c a dalších mitochondriálních proteinů IMS se tedy mohou vrátit zpět na permeabilizované mitochondrie a ovlivnit jejich funkci. Důležité je, že tato smyčka mitochondriálního zesílení kaspázové aktivity může rozhodujícím způsobem určovat odpověď nádorových buněk na cytotoxickou léčbu.

V poslední době se navíc objevily důkazy o existenci mechanismu (mechanismů) aktivace kaspáz nezávislého na cytochromu c a apoptosomu, ale závislého na Apaf-1 . Cílený knock-in varianty cytochromu c, která postrádá apoptogenní vlastnosti, ale má přenos elektronů a antioxidační aktivitu (K72A), umožnil vyhodnotit podíl cytochromu c na apoptóze, aniž by byla ovlivněna jeho funkce při oxidativní fosforylaci (Hao et al., 2005). Je zajímavé, že thymocyty z KA/KA myší byly výrazně citlivější na smrtící podněty včetně etoposidu a γ-záření než Apaf-1(-/-) thymocyty (Hao et al., 2005). Po ošetření γ-zářením byly v apoptotických KA/KA thymocytech účinně aktivovány prokaspázy, ale oligomerizace Apaf-1 nebyla pozorována (Hao et al., 2005), což ukazuje na rozdílný požadavek na cytochrom c a Apaf-1 v apoptóze.

Smac/DIABLO

Další proteiny uvolněné z mitochondrií, jako jsou Smac/DIABLO a Omi/HtrA2, usnadňují aktivaci kaspáz prostřednictvím neutralizace endogenních inhibitorů kaspáz, proteinů inhibitorů apoptózy (IAP). Smac a jeho myší homolog DIABLO jsou jaderně kódované mitochondriální proteiny, které obsahují mitochondriální lokalizační signál, který je při mitochondriálním importu proteolyticky odstraněn a vzniká zralý protein o velikosti 23 kDa (Du et al., 2000; Verhagen et al., 2000). Tento krok zrání obnaží vazebný motiv IAP (IBM) na N-konci Smac/DIABLO (Du et al., 2000) (tabulka 1). Bylo prokázáno, že druhý aktivátor kaspázy/DIABLO odvozený z mitochondrií se váže na XIAP, cIAP1, cIAP2, survivin a Apollon v závislosti na BIR (Vaux a Silke, 2003) (obr. 2),a působí jako homodimer s IBM přítomným v bivalentní konfiguraci (Chai et al., 2000). Jeden dimer Smac/DIABLO váže jednu molekulu XIAP pomocí obou vazebných motivů IAP, přičemž jeden interaguje s BIR2 a druhý s BIR3 (Huang a kol., 2003). Zajímavé je, že stejný žlábek BIR3 váže IBM exponovaný na N-konci (Ala-Thr-Pro-Phe) malé podjednotky kaspázy-9 po jejím autokatalytickém zpracování po Asp315, což umožňuje Smac/DIABLO vytlačit kaspázu-9 z XIAP (Srinivasula et al., 2001) (Tabulka 1).

Fyziologická mitochondriální funkce Smac/DIABLO není známa a DIABLO -/- myši se jeví jako normální (Okada et al., 2002). Ačkoli in vitro bylo štěpení prokaspázy-3 po přidání cytochromu c v lyzátech Smac -/- buněk inhibováno, Smac -/- myši a buňky normálně reagovaly na apoptotické podněty, jako je UV záření, staurosporin, etoposid a TNF/cyklohexamid (Okada et al., 2002). Tato pozorování naznačují existenci nadbytečných faktorů kompenzujících ztrátu Smac/DIABLO, pravděpodobně HtrA2/OMI.

Omi/HtrA2 je jaderně kódovaný protein o velikosti 49 kDa s N-terminálním mitochondriálním lokalizačním signálem, který zprostředkovává jeho translokaci do mitochondriálního mezimembránového prostoru (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). Omi/HtrA2 je v intermembránovém prostoru zpracován do zralé formy o velikosti 37 kDa, přičemž se na jeho N-konci uvolní IBM (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002) (tab. 1). Přestože rekombinantní Omi/HtrA2 může katalyzovat vlastní zrání in vitro, proteáza zodpovědná za jeho zrání v buňkách zůstává neznámá (Martins et al., 2002). Omi/HtrA2 hraje zásadní roli v regulaci mitochondriální homeostázy vyžadující její proteolytickou aktivitu, ačkoli molekulární cíle a interakční partneři Omi/HtrA2 v mitochondrii dosud nebyly definovány (Saelens et al., 2004). Jakmile se Omi/HtrA2 uvolní z mitochondrií do cytosolu, podporuje buněčnou smrt způsobem závislým na kaspáze tím, že antagonizuje IAP, a způsobem nezávislým na kaspáze jako proteáza (Saelens et al., 2004). Podobně jako Smac/DIABLO blokuje Omi/HtrA2 IAPs prostřednictvím svého N-koncového vazebného motivu IAP, který je prezentován v trimerní konfiguraci (Li et al.,

Ačkoli uvolnění cytochromu c do cytosolu přímo spouští aktivaci kaspázy-3 prostřednictvím tvorby apoptosomového komplexu obsahujícího cytochrom c/Apaf-1/kaspázu-9, Smac/DIABLO a Omi/HtrA2 nepřímo podporují aktivaci kaspázy prostřednictvím antagonizace inhibičních účinků na IAPs (Saelens et al., 2004). Mezi pro- a antiapoptotickými efektorovými molekulami tedy existuje dynamická rovnováha, která umožňuje buňce vyrovnat se s omezeným poškozením mitochondrií, přičemž v takovém případě mohou IAPs adekvátně blokovat aktivaci kaspáz iniciovanou malým množstvím uvolněného cytochromu c. Avšak za okolností, kdy mitochondriální poškození postupuje nebo současně postihuje více mitochondrií, může být antiapoptotická překážka kladená IAPs překonána vyšší cytosolickou koncentrací jejich antagonistů Smac/DIABLO a HtrA2/OMI, které neutralizují IAPs přímou vazbou.

Existuje stále více důkazů, že nádorové buňky mají vnitřní snahu o apoptózu, kterou drží IAPs pod kontrolou. Za tímto účelem byly v různých nádorových buněčných liniích a nádorových tkáních, nikoli však v normálních buňkách, zjištěny vysoké bazální hladiny aktivity kaspázy-3 a kaspázy-8 a aktivní fragmenty kaspázy-3 při absenci apoptózy (Yang et al., 2003a). Nádorové buňky, ale nikoli normální buňky, také exprimovaly vysoké hladiny IAP, což naznačuje, že zvýšená exprese IAP působí proti vysoké bazální aktivitě kaspáz selektivně v nádorových buňkách (Yang et al., 2003a). Proto jsou strategie zaměřené na IAP považovány za slibný přístup ke zvýšení účinnosti cytotoxických terapií selektivně u nádorových buněk. Za tímto účelem snížila transfekcí vynucená exprese Smac/DIABLO práh pro usmrcení vyvolané TRAILem u různých nádorů (Ng a Bonavida, 2002; Okano a kol., 2003) a také senzibilizovala nádorové buňky pro chemoterapii (McNeish a kol., 2003; Zhao a kol., 2006). Zdá se však, že translokace endogenního Smac/DIABLO do cytosolu během apoptózy vyvolané protinádorovými léčivy nehraje za určitých podmínek hlavní roli, například u buněk lidského karcinomu plic při léčbě etoposidem (Bartling et al., 2004). Snížení regulace Smac/DIABLO pomocí malé interferující RNA (siRNA) nemělo u těchto buněk vliv na usmrcení etoposidem, ačkoli peptid Smac-N7 vážící IAP zvýšil apoptózu vyvolanou etoposidem (Bartling et al., 2004). Tyto údaje naznačují, že nedostatek Smac/DIABLO může být v některých nádorových buňkách kompenzován působením nadbytečných determinant.

Mitochondriální mediátory apoptózy nezávislé na kaspáze

Po svém uvolnění z mitochondriálního mezimembránového prostoru přispívá HtrA2/OMI k buněčné smrti také způsobem nezávislým na kaspáze jako proteáza kromě podpory apoptózy způsobem závislým na kaspáze tím, že antagonizuje IAP (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). Údaje in vitro prokázaly degradaci XIAP, cIAP1, cIAP2 a Apollon proteázovou aktivitou HtrA2/OMI (Suzuki et al., 2004). Trencia et al. (2004) navíc prokázali interakci antiapoptotického PED/PEA-15 s cytosolickým HtrA2/OMI a jeho degradaci. Snížení hladiny HtrA2/OMI v buňkách pomocí antisense nebo RNA interference snižuje citlivost různých nádorových buněčných linií k buněčné smrti vyvolané staurosporinem, Fas, UV zářením nebo cisplatinou (Martins et al.,

Dále se AIF a endonukleáza G uvolňují z mitochondrií při permeabilizaci vnější mitochondriální membrány a přemisťují se do jádra, kde přispívají ke kondenzaci jaderného chromatinu a rozsáhlé fragmentaci DNA (Cande et al., 2004; Saelens et al., 2004). O tom, zda se tyto dva proteiny uvolňují před, společně nebo až po cytochromu c, se vedou kontroverzní diskuse (Arnoult et al., 2002). Také stále není přesně jasné, jak AIF přispívá k fragmentaci jaderné DNA, protože postrádá vlastní DNázovou aktivitu. V savčích buňkách spolupracuje s AIF při indukci rozpadu DNA cyklofilin A, peptidyl-prolyl cis-trans izomeráza (Cande et al., 2004).

Přerušení vnitřní dráhy u rakoviny

Mutace v genech zapojených do regulace mitochondriální dráhy jsou u nádorových buněk velmi časté. Vzhledem k tomu, že většina protinádorových terapií vyvolává v nádorových buňkách apoptózu spuštěním intrinsické dráhy, jsou tyto mutace obvykle spojeny s rezistencí k léčbě. Například nadměrná exprese Bcl-2 v důsledku chromozomální translokace onkogenu bcl-2 do lokusu genu pro těžký řetězec imunoglobulinu je spojena s přibližně 85 % lidských folikulárních lymfomů (Tsujimoto et al., 1984). Pokusy s transgenními myšmi prokázaly, že nadměrná exprese Bcl-2 může podporovat neoplastickou transformaci B a T lymfocytů a myeloidních buněk (McDonnell a Korsmeyer, 1991; Traver et al., 1998).

Vzhledem k tomu, že nadměrná exprese antiapoptotických členů rodiny Bcl-2 podporuje onkogenezi, vyplývá z toho, že proapoptotičtí členové této rodiny s více BH doménami působí jako nádorové supresory. Protože se však role Bax a Bak v apoptóze do značné míry překrývají, bylo obtížné určit, zda tato hypotéza platí, a skutečně bax-/- myši nejsou výrazně náchylné k neoplazii (Knudson et al., 2001). Nicméně somatické mutace, které inaktivují gen bax, byly nalezeny u některých solidních nádorů a hematologických malignit. Za tímto účelem byly popsány jednonukleotidové substituce nebo frameshift mutace, které inaktivují gen Bax u karcinomu tlustého střeva s deficitem mismatch repair (MMR) nebo hematopoetických malignit (Rampino et al., 1997; Kitada et al., 2002).

Navíc přibývá důkazů, že proteiny obsahující pouze BH3 mohou přispívat k potlačení maligní transformace, což naznačuje, že mohou fungovat jako bona fide tumor supresory. Například bylo prokázáno, že ztráta jedné alely Bim urychluje lymfomagenezi B-buněk indukovanou expresí transgenu c-myc (Egle et al., 2004), což je v souladu s klíčovou úlohou Bim jako regulátoru lymfoidní homeostázy (Strasser, 2005). Je zajímavé, že u pacientů s lymfomem z plášťových buněk byly nedávno identifikovány homozygotní delece v chromozomální oblasti, v níž se nachází gen bim (Tagawa et al., 2005). U myší, kterým chybí bid, se spontánně vyvíjí myeloproliferativní porucha, která může progredovat do malignity připomínající chronickou myelomonocytární leukemii (CMML) (Zinkel et al., 2003). Navíc bylo zjištěno, že RNAi zprostředkované potlačení Pumy urychluje Myc indukovanou lymfomagenezi (Hemann et al., 2004).

Kromě genetických změn je aberantní exprese proteinů rodiny Bcl-2 většinou regulována na transkripční nebo posttranskripční úrovni. Například exprese několika antiapoptotických proteinů rodiny Bcl-2, například Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 nebo Bfl-1, je transkripčně regulována NF-κB (Cory a Adams, 2002).

Kromě proteinů rodiny Bcl-2 byla u karcinomu vaječníků, melanomu a leukémie zjištěna snížená nebo chybějící aktivita Apaf-1. Navíc mutace v nádorovém supresorovém genu p53, což je nejčastější genetický defekt u lidských nádorů, zasahují do vnitřní dráhy. Aktivace p53 například reguluje řadu genů, které mají ve svých promotorech prvky reagující na p53, jako jsou proapoptotické proteiny Puma, Noxa a Bid (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). V důsledku toho jsou buňky, v nichž je stabilizován p53, senzitivní pro aktivaci mitochondriální dráhy buněčné smrti. Kromě toho může p53 přímo ovlivňovat integritu mitochondrií bez nutnosti aktivace genů. Bylo totiž zjištěno, že p53 se může v mitochondriích vázat na Bcl-2 a Bcl-XL, čímž podporuje destabilizaci mitochondrií (Mihara et al., 2003).

Signalizace prostřednictvím vnitřní dráhy v terapii rakoviny

Většina konvenčních chemoterapeutik, například etoposid, doxorubicin, cisplatina nebo paklitaxel, vyvolává mitochondriální permeabilizaci nepřímo tím, že spouští poruchy intermediárního metabolismu nebo zvyšuje koncentraci proapoptotických druhých poslů, například indukcí exprese p53, indukcí ceramidové/GD3 dráhy, indukcí ligandového systému CD95/CD95L, ovlivněním proteinů podobných Bcl-2 a/nebo narušením redoxní nebo energetické rovnováhy.

Existuje stále více důkazů o existenci vzájemného působení jádra a mitochondrií po poškození DNA. Například apoptotické signály vznikající v důsledku poškození DNA mohou být přenášeny prostřednictvím nádorového supresoru p53 do mitochondrií, které následně uvolňují do cytoplazmy apoptogenní faktory, které aktivují následné destrukční programy (Moll et al., 2005). p53 může nepřímo zapojit mitochondriální dráhu transkripční aktivací exprese proapoptotických proteinů Bcl-2, například Bid, Puma nebo Noxa (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Kromě toho může p53 přímo vyvolat permeabilizaci vnější mitochondriální membrány způsobem nezávislým na transkripci prostřednictvím přímé aktivace proapoptotických proteinů Bcl-2 Bax nebo Bak nebo prostřednictvím vazby a inaktivace antiapoptotických proteinů Bcl-2, například Bcl-2 nebo Bcl-XL (Mihara et al., 2003; Chipuk et al., 2004; Moll et al., 2005). Důležité je, že se nedávno ukázalo, že mitochondriálně cílený p53 má nádorové supresorové aktivity také in vivo (Talos et al., 2005).

Kazpáza-2 má navíc schopnost zapojit se do mitochondriální apoptotické dráhy v reakci na poškození DNA permeabilizací vnější mitochondriální membrány a/nebo narušením asociace cytochromu c s vnitřní mitochondriální membránou. Proto byly buňky stabilně transfekované antisense prokaspase-2 nebo přechodně exprimující siRNA refrakterní vůči uvolňování cytochromu c a různým následným událostem, jako je aktivace kaspáz a fragmentace DNA, vyvolaným poškozením DNA (Lassus et al., 2002; Robertson et al., 2002). Kaspáza-2 může na mitochondrie působit nepřímo, například štěpením proapoptotického proteinu Bid, po kterém následuje jeho translokace do mitochondrií a indukce uvolnění cytochromu c (Guo et al., 2002). Kromě toho může kaspáza-2 přímo permeabilizovat vnější mitochondriální membránu a stimulovat uvolňování cytochromu c a Smac/DIABLO, pravděpodobně v důsledku přímé interakce zpracované kaspázy-2 s předpokládanými proteiny a/nebo fosfolipidy umístěnými ve vnější mitochondriální membráně nebo v místech kontaktu mezi vnější a vnitřní membránou (Robertson et al., 2004). Permeabilizace vnější mitochondriální membrány vyžaduje zpracování zymogenu kaspázy-2, ale ne související proteolytickou aktivitu, a probíhá nezávisle na několika proteinech rodiny Bcl-2, včetně Bax, Bak a Bcl-2 (Robertson et al., 2004). Dále se také ukázalo, že kaspáza-2 má překvapivou schopnost narušit asociaci mezi cytochromem c a aniontovými fosfolipidy, zejména kardiolipinem, a tím uvolnit další cytochrom c do cytosolu (Enoksson et al., 2004). Nedávno bylo zjištěno, že při poškození DNA se kaspáza-2 aktivuje v takzvaném PIDDosomu, komplexu proteinu PIDD obsahujícího doménu smrti indukovanou p53, kaspázy-2 a adaptorového proteinu RAIDD (Tinel a Tschopp, 2004), což ukazuje na existenci nukleo-mitochondriální apoptotické dráhy.

Dále se uvádí, že histon H1.2 hraje důležitou roli při přenosu apoptotických signálů z jádra do mitochondrií po dvouřetězcových zlomech DNA (Konishi et al., 2003). Jaderný histon H1.2 se po dvouřetězcových zlomech DNA uvolňuje do cytoplazmy mechanismem závislým na p53 a indukuje uvolňování cytochromu c z izolovaných mitochondrií způsobem závislým na Bak (Konishi et al., 2003). Snížení exprese H1.2 zvýšilo odolnost buněk vůči apoptóze vyvolané rentgenovým zářením nebo etoposidem (Konishi et al., 2003).

Mimo to byl nedávno sirotčí jaderný receptor Nur77 (známý také jako TR3) spojen s apoptotickým mechanismem Bcl-2 v mitochondriích (Lin et al., 2004). Vazba Nur77 na oblast N-koncové smyčky Bcl-2, která se nachází mezi jeho doménami BH4 a BH3, vyvolá konformační změnu Bcl-2, která obnaží jeho doménu BH3, což vede k přeměně Bcl-2 z protektora na zabijáka (Lin et al., 2004). Zajímavé je, že zvýšená hladina člena rodiny Nur77 byla u pacientů spojena s příznivou odpovědí na chemoterapeutika (Shipp et al., 2002).

Při buněčném stresu včetně chemoterapeutik se navíc specifičtí proapoptotičtí členové rodiny Bcl-2 aktivují, derepresují nebo indukují, a působí tak jako senzory. Aktivita pouze BH3 proteinů je držena na uzdě několika mechanismy, které za normálních okolností udržují tyto proteiny stranou od multidoménových protějšků Bcl-2, avšak umožňují jejich rychlou aktivaci za stresových podmínek (Bouillet a Strasser, 2002). Jak bylo uvedeno výše, proteiny rodiny Bcl-2, jako jsou Bid, Puma nebo Noxa, jsou pod transkripční kontrolou nádorového supresoru p53, a proto jsou v reakci na látky poškozující DNA regulovány (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). BH3-only protein Bim, který je spojen s cytoskeletem vazbou na mikrotubuly, se uvolňuje a aktivuje vnitřní dráhu po léčbě taxolem, který působí na sestavu mikrotubulů (Sunters et al., 2003). Nedávno bylo prokázáno, že paklitaxel indukuje akumulaci Bim a apoptózu závislou na Bim v epiteliálních nádorech in vitro a také in vivo (Tan et al., 2005). Aktivní proteiny obsahující pouze BH3 se vážou a působí proti antiapoptotickým a v některých případech aktivují multidoménové proapoptotické členy rodiny Bcl-2, což vede ke ztrátě propustnosti mitochondriální membrány (Bouillet a Strasser, 2002). Způsob, jakým proteiny Bcl-2 vyvolávají narušení vnější mitochondriální membrány, je stále předmětem diskuse a může zahrnovat schopnost některých proteinů rodiny Bcl-2 vytvářet póry a samooligomerizovat se, modulaci pórů mitochondriálního přechodu propustnosti proteiny rodiny Bcl-2 a/nebo změny lipidů a interakce lipidových proteinů v mitochondriálních membránách. Chemoterapeutika, jako je paklitaxel, navíc způsobují hyperfosforylaci a inaktivaci Bcl-2 a současně podporují otevření póru přechodu propustnosti (PT) (Ruvolo et al.,

Chemoterapeutika mohou také vyvolat nebo usnadnit permeabilizaci vnější mitochondriální membrány prostřednictvím změn buněčných redoxních potenciálů v důsledku zvýšené tvorby reaktivních forem kyslíku (nebo snížení jejich detoxikace), vyčerpání redukovaného glutathionu nebo vyčerpání NADPH, protože mitochondriální megakanál má několik míst citlivých na redox (Debatin et al., 2002). Kromě toho by změny v energetickém metabolismu, například vyčerpání ADP a ATP, mohly usnadnit otevření komplexu permeability transition pore complex (PTPC), protože ADP a ATP jsou fyziologickými ligandy translokátoru adeninových nukleotidů, které fungují jako endogenní inhibitory PTPC (Costantini et al., 2000). Také rozpojení nebo inhibice dýchacího řetězce nebo alkalizace matrix mohou podporovat permeabilizaci mitochondriální membrány. Kromě toho mohou k permeabilizaci mitochondriální membrány přispívat lipidoví poslové, jako je ceramid, který vzniká v buňkách vystavených několika podnětům vyvolávajícím apoptózu, včetně cytotoxických léčiv (Susin et al., 1997). Ve vysokých koncentracích. mohou některé chemoterapeutické léky, například etoposid nebo paklitaxel, také vyvolat permeabilizaci vnější mitochondriální membrány v izolovaných mitochondriích (Robertson et al., 2000; Kidd et al.,

Kromě toho bylo prokázáno, že stále větší počet experimentálních protinádorových léčiv, včetně arsenitu, lonidamidu, syntetického retinoidu CD437 nebo přírodního produktu kyseliny betulinové, působí přímo na mitochondrie (Debatin et al., 2002). Bylo například zjištěno, že kyselina betulinová spouští apoptózu přímým vyvoláním ztráty mitochondriálního membránového potenciálu v izolovaných mitochondriích způsobem, který není ovlivněn inhibitorem kaspázy Z-VAD-fmk, a přesto je inhibován BA, inhibitorem PTPC, nebo Bcl-2 a Bcl-XL (Fulda et al.,

Strategie zaměřené na intrinsickou dráhu

proteiny rodiny Bcl-2

Protože antiapoptotické proteiny Bcl-2, které účinně blokují intrinsickou dráhu apoptózy, se vyskytují ve zvýšené míře u lidských nádorů hematologického i nehematologického původu (Cotter, 2004), představují slibné cíle pro terapeutické zásahy. V důsledku toho bylo vyvinuto několik strategií zaměřených na proteiny Bcl-2, například antisense techniky, peptidy s doménou BH3 nebo syntetická malomolekulární léčiva zasahující do funkce proteinů podobných Bcl-2. Pro snížení exprese Bcl-2 byly společností Genta Incorporated (Berkeley Heights, NJ, USA) vyvinuty Bcl-2 antisense oligonukleotidy (genasense). Genasense je syntetický, 18bázový, jednořetězcový fosforothioátový oligonukleotid, který selektivně cílí na prvních šest kodonů (tj. 18 bází) otevřeného čtecího rámce mRNA kódujícího protein Bcl-2 (Cotter, 2004). Léčba genasense výrazně zvýšila protinádorovou aktivitu mnoha chemoterapeutik, například taxanů, antracyklinů, alkylátorů nebo látek obsahujících platinu (Cotter, 2004). V preklinickém modelu melanomu zvýšila předběžná léčba genasense chemosenzitivitu lidského melanomu (Jansen et al., 1998). Také v klinické studii bylo zjištěno, že genasense působí jako chemosenzibilizátor dakarbazinu u pacientů s maligním melanomem (Jansen et al., 2000). Pro optimalizaci terapie založené na antisense byly následně navrženy bispecifické antisense oligonukleotidy namířené proti sekvenci, která je vysoce homologní v Bcl-2 a Bcl-xL, ale chybí v mRNA Bcl-xS (Zangemeister-Wittke et al., 2000). Současná downregulace Bcl-2 i Bcl-xL vyvolala apoptózu a zvýšila chemosenzitivitu u různých nádorových buněk (Gautschi et al., 2001; Tortora et al., 2003; Milella et al., 2004; Yamanaka et al., 2005).

Dále byly vyvinuty peptidy s doménou BH3 nebo syntetické inhibitory s malými molekulami, které se zaměřují na anti-apoptotické proteiny podobné Bcl-2. Tyto peptidy se zaměřují na anti-apoptotické proteiny. Doména BH3 se skládá z devítiaminokyselinového amfipatického α-helixu, který se váže na hydrofobní kapsu proteinů podobných Bcl-2 (Cory a Adams, 2002). Podobně peptidy s doménou BH3 mají za cíl narušit tento komplex, a tím senzibilizovat nádorové buňky k apoptóze (Letai et al., 2002). Navíc substituce BH3 domény Bid nepřirozenými aminokyselinami na povrchu protilehlém k interakční oblasti pomocí sešití uhlovodíků vedla ke vzniku stabilizovaných BH3 peptidů označovaných jako SAHB (stabilized α-helix of Bcl-2 domains) se zlepšenými farmakologickými vlastnostmi (Walensky et al., 2004). Tyto stabilizované peptidy BH3 vyvolávaly apoptózu u různých leukemických buněčných linií a také inhibovaly růst leukemických xenografů u myší bez nežádoucích vedlejších účinků (Walensky et al., 2004).

Také bylo identifikováno několik sloučenin malých molekul zasahujících do funkce Bcl-2/Bcl-xL. Screening chemické knihovny sloučenin schopných vázat se na kapsu BH3 proteinů Bcl-2 vedl k identifikaci HA14-1, sloučeniny, která soutěží s Bakem o vazbu na Bcl-2 (Wang et al., 2000). Screeningem knihovny 16 320 předem vybraných sloučenin na schopnost vytěsnit fluorescenční peptid Bak BH3 z Bcl-xL ve fluorescenčním polarizačním testu identifikovali Degterev et al. (2003) dvě třídy látek nazývaných inhibitory BH3 (BH3I), které rovněž narušují komplex Bcl-xL s Bax a Bad v intaktních buňkách.

Pomocí screeningu založeného na nukleární magnetické rezonanci (NMR), paralelní syntézy a návrhu založeného na struktuře byl nedávno objeven nízkomolekulární inhibitor antiapoptotických proteinů Bcl-2, Bcl-X(L) a Bcl-w, ABT-737. ABT-737 byl účinný jako samostatná látka proti některým lymfomům a solidním nádorům a vykazoval synergickou cytotoxicitu s chemoterapeutiky a zářením (Oltersdorf et al., 2005).

Agonisté Smac/DIABLO

Pro návrh potenciálně terapeutických malých molekul zaměřených na XIAP přitahuje největší pozornost vazebný žlábek domény BIR3 XIAP, na který se Smac/DIABLO váže po svém uvolnění z mitochondrie. Strukturní analýza poskytla jasné zdůvodnění pro syntézu malých sloučenin, které mohou napodobit aktivitu Smac/DIABLO vytěsňující kaspázu-9 z BIR3 XIAP (Chai et al., 2000; Wu et al., 2000). Pro zvýšení intracelulárního přenosu byly peptidy Smac navázány na nosič, například na transdukční motiv proteinu HIV Tat (Fulda et al., 2002), penetrační sekvenci Drosophila antennapaedia (Arnt et al., 2002) nebo polyargininový úsek (Yang et al., 2003b). Bylo zjištěno, že heptapeptid představující N-konec zralého Smac/DIABLO, který je nezbytný pro vazbu na XIAP, podporuje aktivaci kaspáz a senzibilizuje různé nádorové buněčné linie a také primární nádorové buňky odvozené od pacientů k apoptóze vyvolané ligací receptorů smrti nebo cytotoxickými léky (Fulda et al., 2002). Důležité je, že peptidy Smac dokonce zvýšily protinádorovou aktivitu TRAIL in vivo na modelu intrakraniálního xenograftu maligního gliomu (Fulda et al., 2002b). Podobně 8merový peptid (AVPIAQKS) fúzovaný s proteinovou transdukční doménou penetratinu Drosophila antennapaedia byl schopen vstoupit do buněk karcinomu prsu, vázat XIAP a cIAP1 a potencovat kaspázovou aktivitu vyvolanou řadou protinádorových léčiv, včetně paklitaxelu, etoposidu, 7-ethyl-10-hydroxycamptotecinu (SN-38) a doxorubicinu (Arnt et al., 2002). Kromě toho byla na základě trojrozměrné struktury Smac/DIABLO v komplexu s XIAP BIR3 navržena peptidomimetika Smac, která ve spolupráci s TRAIL, TNFα, cisplatinou nebo etoposidem vyvolávají apoptózu v nádorových buňkách (Li et al., 2004; Sun et al., 2004a, 2004b, 2005).

Pro cílení na IAP byly následně vyvinuty nepeptidické antagonisty malých molekul XIAP, které byly získány screeningem fágové knihovny nebo knihovny polyfenylurey (Schimmer et al., 2004; Wang et al., 2004). Kromě toho byl nedávno objeven přírodní produkt embelin z japonské byliny Ardisia jako buněčně propustný, nepeptidický, nízkomolekulární inhibitor XIAP prostřednictvím strukturního výpočetního screeningu databáze trojrozměrných struktur tradiční bylinné medicíny (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Bylo prokázáno, že Embelin účinně překonává ochranný účinek XIAP v buňkách karcinomu prostaty s vysokou endogenní hladinou XIAP nebo v buňkách Jurkat transfekovaných XIAP prostřednictvím vazby na doménu XIAP BIR3 (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Agonisté Smac nebo nízkomolekulární antagonisté XIAP tak mohou být slibnými kandidáty pro léčbu rakoviny tím, že selektivně potencují účinnost cytotoxických terapií v nádorových buňkách.

.