- Hvad skal man vælge til mikrobiomundersøgelser
- Hvad er 16S rRNA-gen-sekventering?
- Hvad er Shotgun Metagenomic Sequencing?
- 16S/ITS-sekventering vs. shotgun metagenomisk sekventering
- Taxonomiopløsning
- Funktionsprofilering
- Mikrobiel dækning og anbefalet prøvetype
- Falsk positive
- Værts-DNA-interferens
- DNA-input
- Her for at hjælpe
- Find ud af, hvilken sekventeringsmetode der er bedst for dig. Tal med de eksperter, der leverer ZymoBIOMICS sekventeringstjenester.
Hvad skal man vælge til mikrobiomundersøgelser
16S-sekventering eller shotgun-sekventering? Næsten alle mikrobiomforskere stiller sig selv dette spørgsmål, når de planlægger en ny undersøgelse, fordi langt de fleste mikrobiompublikationer anvender enten 16S rRNA-gen-sekventering eller shotgun metagenomisk sekventering til at generere rådata til efterfølgende mikrobielle profilering eller metagenomiske analyser. Hver metode har sine fordele og ulemper, så hvilken metode skal du vælge?
Hvad er 16S rRNA-gen-sekventering?
16S rRNA-gen-sekventering, eller blot 16S-sekventering, anvender PCR til at målrette og amplificere dele af de hypervariable regioner (V1-V9) af bakteriens 16S rRNA-gen1. Amplikoner fra separate prøver forsynes derefter med molekylære stregkoder, lægges sammen og sekventeres. Efter sekventeringen analyseres rådataene med en bioinformatisk pipeline, som omfatter trimning, fejlkorrektion og sammenligning med en 16S-referencedatabase. Efter at læsningerne er blevet tildelt en fylogenetisk rang, kan der genereres en taksonomiprofil. På samme måde følger ITS-sekventering den samme strategi, men er rettet mod ITS-regionen (Internal transcribed spacer), der findes i svampegenomer.
Hvad er Shotgun Metagenomic Sequencing?
I modsætning til 16S-sekventering, der kun er rettet mod 16S rRNA-gener, sekventerer shotgun metagenomisk sekventering alt givet genomisk DNA fra en prøve. Arbejdsgangen til forberedelse af biblioteket svarer til almindelig sekventering af hele genomet, herunder tilfældig fragmentering og adapterligning. En typisk arbejdsgang til taksonomianalyse af metagenomiske shotgun-data omfatter kvalitetstrimning og sammenligning med en referencedatabase, der omfatter hele genomer (f.eks. Kraken2 og Centrifuge3) eller udvalgte markørgener (MetaPhlAn4 og mOTU5), for at generere en taksonomiprofil. Da shotgun-metagenomisk sekventering dækker alle genetiske oplysninger i en prøve, kan dataene anvendes til yderligere analyser, f.eks. metagenomisk samling og binning, profilering af metaboliske funktioner og profilering af antibiotikaresistensgener.
16S/ITS-sekventering vs. shotgun metagenomisk sekventering
Hvis din undersøgelse kræver genomiske analyser ud over taxonomiprofilering, f.eks. analyse af metaboliske veje, bør du overveje shotgun metagenomisk sekventering på grund af dens større genomiske dækning og dataudgang. Hvis sammensætningsprofilering er hovedformålet med undersøgelsen, har begge teknikker fordele og ulemper, der skal overvejes (tabel 1).
Taxonomiopløsning
Taxonomiopløsningen af 16S/ITS-sekventering afhænger af de variable regioner, der er målrettet, selve organismen og algoritmen til sekvensanalyse. I de seneste år har nogle fejlkorrektionsmetoder, f.eks. DADA26 , dramatisk forbedret nøjagtigheden og taxonomiopløsningen af denne teknik. Med DADA2 er opløsning på artsniveau for mange organismer ved hjælp af almindelig 16S-sekventering nu en realitet. Men i teorien kan man ved hjælp af metagenomisk shotgun-sekventering opnå opløsning på stammeplan, fordi den kan dække alle genetiske variationer. I praksis er der dog stadig tekniske udfordringer med hensyn til nøjagtigheden af opløsningen på stammeplan. Alligevel opnår shotgun-metagenomisk sekventering en højere opløsning sammenlignet med 16S/ITS-sekventering.
Funktionsprofilering
Hvis analyse af metaboliske funktioner er et mål, vil de fleste forskere hurtigt se bort fra 16S- og ITS-sekventering. Men der findes nogle værktøjer til at kunne udlede metabolisk funktion fra taxonomidata, f.eks. PICRUSt7. Men generelt anvendes shotgun-metagenomisk sekventering ofte, når der kræves funktionel profilering på grund af den ekstra gen-dækning.
Mikrobiel dækning og anbefalet prøvetype
Shotgun-sekventering undersøger alt metagenomisk DNA, mens 16S-sekventering kun undersøger 16S rRNA-gener, som også lider under ufuldstændig primerdækning. Førstnævnte har derfor en større dækning på tværs af domæner. Hvorfor anføres det så i tabel 1, at 16S/ITS-sekventering er bedre med hensyn til bakterie- og svampedækning? Dette skyldes artsdækningen i de tilgængelige referencedatabaser, fordi disse sekventeringsmetoders taxonomiske forudsigelse i høj grad afhænger af den anvendte referencedatabase. I øjeblikket er dækningen af 16S/ITS-databaser meget bedre end helgenomdatabaser. Det skyldes, at hele genomer af mikrober, der er forbundet med det menneskelige mikrobiom, er meget bedre undersøgt end genomer fra mikrober, der er forbundet med andre miljøer. Derfor anbefales det at anvende shotgun-metagenomisk sekventering til prøver med relation til humant mikrobiom, f.eks. afføring og spyt, hvis taxonomiprofilering er hovedformålet.
Metagenomisk sekventering har desuden en større afhængighed af referencedatabasen. Hvis en bakterie f.eks. ikke har nogen nært beslægtet repræsentant i 16S-referencedatabasen, kan man måske identificere den på en højere fylogenetisk rang eller som en ukendt bakterie. Men i tilfælde af shotgun-metagenomisk sekventering er det sandsynligt, at hvis en bakterie ikke har en nært beslægtet (et genom fra samme slægt) i referencegenomdatabasen, vil man helt overse den. ZymoBIOMICS Spike-in Control I indeholder f.eks. to mikrober, der er fremmede for det menneskelige mikrobiom (Imtechella halotolerans og Allobacillus halotolerans), hvis genomer tidligere ikke var tilgængelige. Hvis du spike det i en fækalprøve og sekventerer med shotgun-sekventering, vil de fleste bioinformatiske pipelines overse dem helt, medmindre du manuelt tilføjer disse to genomer i referencedatabasen. Hvis de derimod analyseres med 16S-sekventering, vil de blive identificeret på grund af tilstedeværelsen af deres 16S-sekvens i referencedatabaser.
Falsk positive
Fejlkorrektionsværktøjer, såsom DADA2, forbedrer ikke kun taxonomiopløsningen af 16S/ITS-sekventering, men de forbedrer også nøjagtigheden. Dette er påvist ved sekventering af DNA fra det mikrobielle mock-samfund (f.eks. ZymoBIOMICS Microbial Community Standard). Alle 16S-sekvenser genfindes uden fejl i sekvensen, dvs. uden falske positive resultater. Men med shotgun-metagenomisk sekventering vil den bioinformatiske analyse sandsynligvis forudsige, at der findes flere “nært beslægtede” genomer, medmindre der findes et perfekt repræsentativt genom i referencedatabasen for en mikrobe, der sekventeres, og det er sandsynligt, at der findes flere “nært beslægtede” genomer. Disse nært beslægtede genomer kan stamme fra forskellige arter af samme slægt eller endog fra forskellige slægter. Lad os f.eks. antage, at der findes tre nært beslægtede mikrober, A, B og C, og at de har nogle sekvenser til fælles. Art A deler kun nogle sekvenser med B og nogle andre sekvenser kun med C. Hvis referencedatabasen kun indeholder genomer fra B og C, vil bioinformatikken, når A blev sekventeret, forudsige, at både B og C er til stede. F.eks. kan både A og B være stammer af Escherichia coli, og C er Salmonella enterica; de sekvenser, som kun deles af B og C, kan stamme fra en horisontal genoverførsel, som er almindelig mellem nært beslægtede mikrober. På grund af dette er 16S/ITS-sekventering bedre med hensyn til falsk positive resultater.
Værts-DNA-interferens
Anstedeværelsen af for meget værts-DNA kan forårsage uspecifik amplifikation i biblioteksfremstillingsprocessen ved 16S- og ITS-sekventering, men virkningen kan kontrolleres ved at justere PCR-cyklusser og ændre primere. På den anden side er interferens fra værts-DNA et langt vanskeligere problem for shotgun-metagenomisk sekventering, selv om omkostningerne til sekventering er faldet dramatisk. Afhængigt af prøvetypen kan nogle prøver indeholde >99% humant værts-DNA, hvilket ikke blot øger sekvensomkostningerne, men også indfører usikkerhed i målingen. Det er derfor, at mange forskere ser på udtømning af værts-DNA, f.eks. HostZERO Microbial DNA Kit, før bibliotekspræparationen af shotgun-sekventering. Der er dog muligvis ikke nok mikrobielt genomisk DNA tilbage til shotgun-sekventering efter udtømning af værts-DNA, som typisk kræver et minimumsinput på 1ng. Interferencen af værts-DNA er grunden til, at overfladisk shotgun-sekventering kun anbefales til humane afføringsprøver.
DNA-input
Mens Shotgun-metagenomisk sekventering kræver et DNA-input på mindst 1 ng, er 16S/ITS-sekventering meget mere følsom med inputminima på femtogrammer eller endda så lavt som 10 kopier af 16S rRNA-gener.
Her for at hjælpe
Valget mellem 16S-sekventering og shotgun-metagenomisk sekventering er et kritisk skridt for alle mikrobiomundersøgelser. Ud over budgettet skal der tages hensyn til mange aspekter af projektet, herunder prøvetype, ønskede analyser, taxonomisk opløsning og målorganismer. Hvis du tager disse overvejelser i betragtning, vil det hjælpe dig med at vælge den rigtige sekventeringsmetode til dit næste mikrobiomprojekt. ZymoBIOMICS’ mikrobiom-seksekventeringstjenester tilbyder 16S-, ITS- og shotgun-sekventering som komplette tjenester fra DNA-udtrækning til sekventering og bioinformatik. Eksperterne i sekventering og bioinformatik hos Zymo Research hjælper dig gerne med at vælge den rigtige sekventeringsmetode til din undersøgelse.
Find ud af, hvilken sekventeringsmetode der er bedst for dig. Tal med de eksperter, der leverer ZymoBIOMICS sekventeringstjenester.
Få mere at vide
1. Laudadio I, Fulci V, Stronati L, Stronati L, Carissimi C. Next-Generation Metagenomics: Metodologiske udfordringer og muligheder. Omics a Journal of Integrative Biology 2019 23(7): 327-333.
2. Wood DE, Salzberg SL. Kraken: ultrahurtig metagenomisk sekvensklassificering ved hjælp af nøjagtige tilpasninger. Genome Biology 2014 15(3): R46.
3. Kim D, Song L, Breitwieser FP, Salzberg SL. Centrifuge: hurtig og følsom klassificering af metagenomiske sekvenser. Genome Research 2016 26(12): 1721-1729.
4. Segata N, Waldron L, Ballarini A, Narasimhan V, Jousson O, Huttenhower C. Metagenomisk profilering af mikrobielle samfund ved hjælp af unikke kladespecifikke markørgener. Nature Methods 2012 9(8): 811-814.
5. Sunagawa S, et al. Metagenomisk artsprofilering ved hjælp af universelle fylogenetiske markørgener. Nature Methods 2013 10(12): 1196-1199.
6. Callahan BJ, McMurdie PJ, Rosen MJ, Han AW, Johnson AJA, Holmes SP. DADA2: Højopløsende prøveinferens fra Illumina-amplicondata. Nature Methods 2016 13(7): 581-583.
7. Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, Reyes JA, Clemente JC, Burkepile DE, Vega Thurber RL, Knight R, Beiko RG, Huttenhower C. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology 2013 31(9): 814-821.
13. november 2019