Analyse og beskrivelse af stadier af Aspergillus fumigatus biofilmdannelse ved hjælp af scanningelektronmikroskopi

Fra et medicinsk perspektiv er Aspergillus fumigatus en opportunistisk patogen hos immunsvækkede personer, med en sygdomsgrad, der afhænger af værtens immunstatus, og som udviser en dødelighed på 50-95 %. Denne svamp giver anledning til lokale infektioner som f.eks. negle dermatomykoser eller svampekeratitis og til invasive infektioner som f.eks. aspergillose og er den næsthyppigste årsag til svampeinfektioner hos indlagte patienter. A. fumigatus-infektion i luftvejene kan forårsage svampebold i lungerne, invasiv aspergillose, invasiv pulmonal aspergillose (IPA), overfølsomhedspneumonitis, astma, immunoglobulin E-medieret allergisk rhinitis, kronisk nekrotiserende lungebetændelse eller allergisk bronchopulmonal aspergillose (ABPA). Desuden giver den anledning til osteomyelitis og endokarditis.

A. fumigatus udvikler en biofilm, som kan være en af de vigtigste virulensfaktorer . A. fumigatus biofilm udarbejder mycelier indlejret i en EMC in vitro, og biofilmdannelse er blevet beskrevet i humane bronchialepitelceller (HBE) og cystisk fibrose bronchialepitelceller (CFBEC) og hos patienter med cystisk fibrose . Svampebiofilmdannelse på katetre og proteser bidrager til udviklingen af nosokomielle infektioner. Persistens af svampeinfektioner opstår derfor på grund af svampens evne til at danne biofilm på en lang række forskellige former for medicinsk udstyr, og fordi de persisterende celler udgør en vigtig resistensmekanisme. Behandlingen af en etableret biofilm i værten kræver normalt indgift af toksiske koncentrationer af antimikrobielle stoffer, og den anbefalede behandling omfatter fjernelse af det inficerede udstyr; dette er imidlertid en vanskelig og dyr proces. Derfor er svampebiofilm et stort klinisk og økonomisk problem .

I det sidste årti er der blevet offentliggjort adskillige undersøgelser af A. fumigatus’ biofilm, både in vivo (i murine modeller, hos patienter med invasiv lungesvampaspergillose og i primære humane epitelkulturen) og in vitro (på polystyrenplader). Generelt omfatter disse undersøgelser hovedsagelig biofilmens modningsstadie og ECM’s kemiske sammensætning, med få billeder af biofilmstadierne, men en hvilken som helst af disse undersøgelser beskrev alle stadierne af biofilmdannelsen. Oplysningerne er således forskellige fra de bidrag, som vores arbejdsgruppe har ydet.

De vigtigste bidrag fra denne undersøgelse er følgende: i) vi giver en beskrivelse af alle stadier i biofilmdannelsen af A. fumigatus in vitro, over tid, og stadierne understøttes med SEM-billeder; ii) vi analyserede to forskellige oprindelser af isolater: en fra miljøet og en fra en patient med hornhindeulcus; iii) vi rapporterer om mikrohyphaer (klinisk isolat) og svampestrukturer, som hidtil kun sjældent er blevet rapporteret, og som ikke er blevet beskrevet, så vidt vi ved, for Aspergillus-arter; og iv) vi giver en beskrivelse af dispersionstrinnet for dannelse af biofilmkolonisering på nye punkter.

For at analysere den strukturelle organisation af den modne biofilm af A. fumigatus (24 timers inkubation ved 28 °C og 37 °C) blev to stammer, en fra jorden og en anden fra en patient med svampekkeratitis, undersøgt ved SEM. Et overblik over A. fumigatus’ biofilmdannelse, der blev observeret i denne undersøgelse, var, at disse biofilm opførte sig på samme måde, uanset om isolatet var fra jorden eller fra klinikken; der var dog forskelle i henhold til inkubationstemperaturen. Ved 28 °C viste biofilmen stadier svarende til dem, der er beskrevet i klassisk mikrobiel vækst: forsinkelses-, eksponentiel og stationær fase; biofilmvæksten var langsom og stabil med en lav ECM-produktion, og svampens strukturelle organisation var enkel (fig. 1). Ved 37 °C viste præstationskurven en ret variabel forsinkelsesfase (tilpasning) og logfase (eksponentiel fase), som kunne være et svar på stress som følge af inkubationen ved høj temperatur; således er der ved 37 °C en reduktion af tilpasningsfasen (forsinkelse) for at opretholde en levedygtig svamp; også logfasen med en diskontinuerlig stigning og med begge adfærdsmønstre er sandsynligvis et adaptivt svar . Således var der ved 37 °C i modningsfasen ekstremt organiserede myceliestrukturer, og disse var reduceret og komprimeret med hyfer, der var fortykket og smeltet sammen til anastomoser, og ECM var rigeligt i sin dækning, omgivende og forstærkende svampestrukturer (Figs. 3 og 4).

I denne undersøgelse giver vi beviser for A. fumigatus biofilmstadier ved hjælp af SEM. De stadier, der blev observeret under biofilmdannelsen, var som følger:

Hæftning, cellekoaggregation og EPS-produktion

I et tidligt stadie (Fig. 2/4 h) hæfter konidier til pladens overflade gennem et samspil af elektrostatiske kræfter mellem svampens cellevægs strukturelle komponenter, og denne tiltrækningskraft er svag og derfor reversibel. Irreversibel og permanent binding er i vid udstrækning blevet beskrevet i specifikke bakterieadhesiner, der er til stede på celleoverfladen, og som binder sig til substratet og EPS, som er stoffer, der produceres af mikroorganismen i de indledende stadier af biofilmdannelsen, og som fungerer ved cellernes vedhæftning til hinanden og til substratet og består af protein-kulhydratkomplekser og glykoproteiner, der hovedsagelig har strukturelle eller klæbende funktioner. Adhesiner er involveret i genkendelse af bakterieceller indbyrdes, herunder bygning af broer og igangsætning af kolonidannelse . Adhesiner er beskrevet i forbindelse med svampeadhæsion under biofilmdannelse. I Candida albicans, Candida glabrata og Candida tropicalis biofilm er der en gruppe af adhæsionsgener, der er involveret i biofilmdannelse, og som tilhører ALS-familien (agglutininin-like sequence), der spiller en nøglerolle i denne proces og koder for proteiner, der har egenskaberne af adhæsienglykoproteiner på celleoverfladen. ALS-familien i C. albicans omfatter otte gener (ALS1-ALS7 og ALS9), der koder for mange overfladeglykoproteiner . Hos A. fumigatus er der på konidiernes overflade identificeret seks hydrofobiner, der består af RodAp-, RodBp-, RodCp-, RodDp-, RodEp- og RodFp-stænger. Denne hydrofobiske egenskab gør det muligt at klæbe til værtscellers proteiner, og de kan være med til at klæbe til polystyrenpladens overflade og igangsætte biofilmdannelsen i alle eller kun i to eller tre af disse . Desuden beskrev Gravelat og kolleger denne svampeinteraktion, og de fandt, at adhesin MedA kontrollerer adhæsion til polystyrenpladen, biofilmdannelse og ekspressionen af konidiationsgener, og at det har hårde virkninger på konidiationsprocessen hos A. fumigatus . Adhesion, der skyldes interaktionen mellem svampens adhæsioner og pladens overflade, og adhæsion konidium-konidium udløser sandsynligvis signalering og fremmer cellekoagregation og EPS-produktion, og disse begivenheder er vist i fig. 2 (4 timer). Samtidig fremskynder EPS svampekoloni-dannelsen ved den tætte binding af cellerne (Fig. 2 (8-12 h)) .

Conidial spiring til hyfer og udvikling

Biofilmdannelse kræver et tærskelantal celler for at gøre det muligt for dem at blive fornemmet og generere et svar, hvilket er en reguleringsmekanisme for genekspression med specifikke funktioner . Ved biofilmdannelse af A. fumigatus er konidieoverfladen, før den begynder at spire konidier, markant hydrofobisk og består af 40 % hydrofobiske methylgrupper. A. fumigatus’ spiring af konidier resulterer i en afbrydelse af det hydrofobiske lag af proteinholdige stoffer og afslører de indre konidievægge, der hovedsagelig består af polysaccharider, som er hydrofile cellevægskomponenter. Der er en hydrofob spids på en enkelt spirende spore. Konidiet mister gradvist sin hydrofobicitet på overfladen, hvorefter den nye vækstspids udviser en sameksistens af hydrofobiske stave og hydrofile polysaccharider . Konidies spiring til hyfer begynder med dannelse af kimrør, som illustreret i fig. 2 (8-12 timer), der har en meget hydrofil cellevæg, og de forventes at fremme hyfevækst .

Biofilmsmodning

A. fumigatus biofilmsmodning blev observeret ved 24 timer, hvilket er en inkubationstid, der svarer til dem, som andre forskere har rapporteret. De strukturelle komponenter omfatter ECM, som er til stede i den modne biofilm og binder cellerne for at danne biofilmens strukturelle basis, herunder EPS og mange organiserede mycelier (Fig. 2 (24 h0) . ECM. Vand udgør den hyppigst forekommende komponent og udgør i biofilmen næsten 97 %. I dette fugtige miljø findes der et ordnet makromolekylært netværk. De vigtigste funktioner, der er beskrevet for EPS i bakterielle biofilm, er følgende: adhæsion, celleaggregation, kohæsion, tilbageholdelse af vand, en beskyttende barriere som specifikke værtsforsvar eller antimikrobielle midler, absorption af organiske forbindelser og uorganiske ioner, enzymatisk aktivitet, næringsstofkilde, udveksling af genetisk information, elektrondonor eller -acceptor, eksport af cellekomponenter, lagring af overskydende energi, tilbageholdelse og stabilisering af enzymer . I svampebiofilm er alle disse funktioner endnu ikke beskrevet, men nogle af dem er ved at blive undersøgt: Matrixens kohæsive og adhæsive kræfter bidrager til biofilmens arkitektoniske og mekaniske stabilitet. Svampecellerne er immobiliseret i matricen og fungerer som et fungerende økosystem i en kontinuerlig forandring og homøostatisk regulering med intense interaktioner, herunder celle-cellekommunikation, der fungerer som den lim, der holder cellerne sammen . Biofilmens struktur varierer meget alt efter den mikroorganisme, der producerer den, og forholdene omkring dens mikrohabitater, herunder de strukturelle forskelle, der er forbundet med den kliniske præsentation. Under de infektiøse processer støtter ECM beskyttelsen mod værten og mikroorganismernes modstandsdygtighed over for lægemidler; ECM er således ikke kun en mekanisk ramme, men også en regulator af cellernes adfærd. Matrixens hydrofobiske proteiner er bundet til de specifikke receptorer på celleoverfladen, hvilket resulterer i adhæsion mellem celle og matrix, som påvirker cellens form, migration, proliferation, celleoverlevelse og metabolisme. Desuden beskytter ECM’en cellerne mod miljømæssige angreb, herunder udtørring, ultraviolet (UV), stråling, oxidation, sult, rovdyrs og værtens immunforsvar og antibiotika . ECM-egenskaberne var tydelige i fig. 2 (24 timer) og fig. 3 og klæbede til svampehyferne i et sammenhængende hylster og blev også observeret med en porøs konsistens (fig. 2 (24 timer)). I A. fumigatus-biofilmen var EPS meget strukturelt arrangeret og havde en rigelig produktion, som dækkede, omgav og forstærkede svampestrukturerne; den fungerer som et kohæsivstof til sammenføjning af hyphae-hyphae-strukturer (kun 37 °C). EPS fremstår med et slimet udseende, der klæber helt fast og dækker hyferne, forårsager anastomose og lukker vandkanalernes lumen (fig. 2 (24 timer), 3 og 4). I tidligere undersøgelser har vores arbejdsgruppe beskrevet A. fumigatus biofilms modningsstadie, hvor lignende strukturer blev observeret.

I nogle mikrokonsortier er den kemiske sammensætning af EPS kendt (bl.a. kulhydratpolymerer, DNA og/eller proteiner og lipider), men andre mangler stadig at blive identificeret. A. fumigatus’-overfladen er sammensat af α-1,3-glucaner, chitin, chitosan, galactomannan, galactosaminogalactan, melanin og proteiner. Cellevæggens sammensætning og strukturelle organisering ommøbleres konstant; selv om de tilstedeværende polysaccharider er de samme, varierer deres mængde og lokalisering med vækstbetingelserne og næringsmiljøet. Heri viste vi den kemiske sammensætning af A. fumigatus biofilm, som blev observeret ved samlokalisering af fluorochromer knyttet til chitin, metabolisk aktivitet og nukleinsyrer ved CLSM; desuden blev overlapningen af fluorochromsignalerne observeret, når disse var knyttet to eller tre af disse (Fig. 5). Den funktion, der blev beskrevet for polysaccharider, såsom α 1,3-glucaner, omfattede, at de spillede en dominerende rolle in vitro i hyfeaggregationen og i hyfeaggregationen i biofilm. Andre polysaccharider i ECM, herunder galactomannan og galactosaminogalactan, er også kendt for at spille en rolle i beskyttelsen af svampen og i adhæsionen af dens biofilmstrukturer til overflader . Ekstracellulært DNA (eDNA) er en vigtig komponent i ECM-biofilmen, som opretholder den strukturelle og arkitektoniske integritet hos A. fumigatus. eDNA dannes ved autolyse og er blevet signifikant forbundet med niveauet af antimykotisk resistens (fig. 5). Desuden kan eDNA være et reservoir af gener til horisontal genoverførsel. DNA giver en mere solid og modstandsdygtig strukturel organisation, når det er samlokaliseret med polysaccharider. eDNA stammer fra svampeceller på grund af A. fumigatus’ sekretion af chitinaser, der begunstiger dets frigivelse (fig. 5) . I biofilm udøver modifikation af cellevæggen en væsentlig indflydelse på resistens over for cellevægmedicin. I A. fumigatus, i en musebiofilmmodel, i multidrug-resistente (MDR) udstrømningspumper (MDR) AfuMDR4-gener, der er forbundet med udledningen af antimikrobielle stoffer, blev genet signifikant induceret ved behandling med voriconazol efter 24 h . FUN1-markøren afslørede metabolisk aktivitet, der er et levende samfund (fig. 5).

Mycelier: Biofilmen viser en kompleks 3-dimensionel (3-D) struktur, der afspejler en koordineret cellulær proces; mycelial udvikling og ekspansion var tydelig, som omfattede komprimerede hyfer-layering netværk, hypha-hypha-adhæsion, anastomose ved begge temperaturer, med optimal rumlig-arrangement-dannede kanaler for at give tilstrømning af næringsstoffer og udstrømning af affaldsprodukter og dermed stabiliserer biofilmen; ved 37 °C var denne kanal mere tydelig (Figs. 2 (24 timer), 3 og 4). Desuden blev disse strukturer observeret af andre forskere . Mikrohyphae: I de tidlige stadier af biofilmsmodning blev der observeret uregelmæssige svampestrukturer, såsom mikrohyphaer, i det kliniske isolat (Fig. 4). Denne kendsgerning er relevant, fordi der er få henvisninger til mikrohyphaer i litteraturen, og dette er første gang, at de er beskrevet hos A. fumigatus. Mikrohyphaer udviser cytoskeletforandringer, der genererer korte og slanke hyfer med tynde vægge og med bøjede ender. Mikrohyphaer er forbundet med en høj enzymatisk aktivitet, der fremmer modningsprocessen og den efterfølgende celledispersion i biofilmstadiet.

Celledispersion

Ved celledispersionen løsnes en del af biofilmen, og den del, der omfatter konidier eller hyfer. Der blev observeret asynkron biofilmudvikling, især i biofilm-matureringsstadiet, hvor de nye konidier var i stand til at spire og producere ny mycelvækst og hyfermodifikationer, såsom krøller (fig. 4 og 6). Cellespredning af biofilmen sker som reaktion på miljøændringer. Dette virker for at fjerne et farligt stof fra biofilmens hoveddel. Denne proces fører til spredning og udbredelse af biofilmcellerne på et nyt sted, hvilket understøttes af komplekse molekylære begivenheder . Biofilm kan ses som beskyttende skaller for de levende celler nedenunder med ekstremt komplekse og utallige funktioner, og der er således tale om virkelig bemærkelsesværdige biologiske konstruktioner. Biofilm yder beskyttelse mod rovdyr eller kemiske angreb og giver de indre celler et medium for intracellulær kommunikation, næringsstofstrøm og overførsel af genetisk materiale. Cellespredningen spreder levedygtige celler til andre steder i miljøet eller inden for en vært, hvor cellerne kan reproducere sig, hvilket gør det lettere for dem at blive ved med at eksistere. Cellespredning sker som følge af knappe næringsstofforhold i miljøet, og det er således en overlevelsesmekanisme. Derfor er cellespredning ikke kun vigtig for at fremme den genetiske diversitet, men også for at undslippe ugunstige levesteder, hvilket bidrager til udviklingen af nye nicher og mikroorganismens persistens på et nyt sted .