Antisense oligonukleotider rettet mod SMN2
ASO’er er enkeltstrengede nukleinsyrer, der er syntetiseret til at være komplementære til en RNA-målsekvens. Når ASO’en er indgivet, optages den i cellen via en endnu dårligt defineret endocytisk mekanisme og kommer derefter ind i kernen, hvor den binder sig til sit pre-mRNA-mål.62 Oprindeligt blev ASO’er anvendt til at undertrykke genekspression enten ved at blokere translation af et RNA-mål eller ved at fremme dets nedbrydning. I dag kan ASO’er også designes til at ændre et måls behandling eller splejsning. SMA-terapeutiske ASO’er er designet til at ændre den alterative splejsning af SMN2 pre-mRNA, således at exon 7 indgår i det endelige forarbejdede transkript. Som omtalt i tidligere kapitler adskiller SMN2 sig fra SMN1 ved en overgang fra C til T, der finder sted seks nukleotider inde i exon 7 (der er andre forskelle mellem de to sekvenser, men dette er den vigtigste funktionelt set). C-to-T-overgangen skaber en udvidet hæmmende kontekst i exon 7 (også kendt som “Exinct”).63 Da exon 7 ellers er svagt defineret på grund af et svagt 5′-splejningssted, er C-to-T-mutationen i SMN2 tilstrækkelig til at tippe balancen fra dets inklusion til eksklusion.
Splejningsregulerende elementer spiller en vigtig rolle ved at bestemme, hvilke steder der genkendes af det cellulære splejningsmaskineri. Placeringen og funktionen af relevante SMN2-elementer blev identificeret ved analyse af splejsningseffekten af en omfattende serie af ASO’er, der er designet til at supplere SMN2-sekvensen på en progressiv iterativ måde63 .-66 Den introniske splejsningssilencer ISS-N1 blev identificeret som et meget kraftigt silencingelement via denne metode; motivet er placeret nedstrøms for 5′-splejningsstedet for exon 7 og binder til splejsningrepressoren hnRNP A1.66-68 ASO’er er blevet designet til pålideligt at inducere inklusion af exon 7 ved at målrette ISS-N1 eller andre reguleringselementer.
ASO’er kan designes til at være bifunktionelle. For eksempel har kimære ASO’er, der fusionerer SR-rekrutteringsdomæner (RS-peptid) med en antisense-sekvens, der undertrykker silencer-motiver, vist sig at øge exon 7-inklusionen og SMN-proteinniveauerne i patientfibroblaster; en enkelt injektion af den bifunktionelle ASO var i stand til at inducere SMN-protein i hjernen hos neonatale mus og resulterede i forlænget levetid.65,69 Denne ASO-designstrategi, kendt som ESSENCE (exon-specific splicing enhancement by small chimeric effectors), blev oprindeligt forfulgt i SMA-terapeutika, men senere undersøgelser viste, at RS-peptidet ikke var nødvendigt for at opnå en robust effekt på SMN2 exon 7-inklusion. Da en kimær tilgang introducerer vanskeligheder med at fremstille ASO’en og begrænser ASO’ens cellulære permeabilitet, er bifunktionelle ASO’er ikke blevet testet udførligt i mus og er i øjeblikket ikke under klinisk udvikling.62
Når ASO’er rettet mod ISS-N1 blev vist at være bemærkelsesværdigt effektive til at fremme exon 7-inklusion, var det næste strategiske spørgsmål at identificere, hvilken ASO-ryggekasse der ville blive anvendt bedst i en potentiel SMA-behandling. De oligonukleotider, der udgør en ASO, modificeres typisk for at optimere farmaceutiske egenskaber såsom cellulær optagelse, toksikologi, farmakokinetik og målbinding. En almindelig tilpasning, som kom ud af et samarbejde mellem Ciba-Geigy Ltd. (nu kendt som Novartis) og Isis Pharmaceuticals (nu kendt som Ionis Pharmaceuticals), er 2′-O-methoxyethyl (2′-MOE), som øger både ASO’s modstandsdygtighed over for nedbrydning af nukleaser og hybridiseringsaffinitet70 . 2′-MOE-oligonukleotider har vist sig at være meget sikre hos gnavere og primater, herunder mennesker62 . Administration af en 2′-MOE ASO, der blokerer ISS-N1, øgede med succes SMN2 exon 7 på en dosis- og tidsafhængig måde hos SMA-mus, hvilket forbedrede den neuromuskulære patologi og øgede overlevelsen dramatisk.68,71,72 Ionis Pharmaceuticals er i samarbejde med Biogen ved at udvikle en 2′-MOE ASO-behandling kaldet nusinersen (også kendt som IONIS-SMNRx og tidligere kaldet ISIS-SMNRx). Prækliniske undersøgelser af nusinersen hos ikke-menneskelige primater viste, at en enkelt intratekal injektion kunne resultere i de vævskoncentrationer, der er nødvendige for betydelige forbedringer af exon 7-inklusionen, og at disse koncentrationer blev opretholdt i flere måneder62 . Lægemidlets lange halveringstid betyder, at patienterne måske kun har brug for en intratekal injektion med få måneders mellemrum.73 I en fase 1 åben undersøgelse hos SMA type II/III-patienter i alderen 2-14 år blev en enkelt injektion af nusinersen godt tolereret og synes at have korreleret med øget HFMSE-score ved den højeste dosis.74 I juni 2015 offentliggjorde Ionis nye data fra et igangværende åbent fase 2-studie af nusinersen hos spædbørn af type I, som viste, at spædbørnene levede længere og opnåede flere motoriske milepæle, end hvad man normalt ville forvente ud fra sygdommens naturlige historie.75 Desuden blev lægemidlets virkningsmekanisme understøttet af data, der viste en stigning i mængden af fuld længde SMN2 mRNA og SMN-protein i hjerne- og rygmarvsvæv fra obduktioner af patienter, der modtog behandling. Ionis offentliggjorde også data fra deres fase 2 open-label extension-studie i børn med type II/III SMA, der viste, at 57 % af forsøgspersonerne opnåede en forbedring på mindst tre point på HFMSE og en gennemsnitlig forbedring på 55 m på 6-Minute Walk Test (6MWT).76 Der gennemføres i øjeblikket fase 3-undersøgelser af nusinersen både hos spædbørn og voksne med SMA (NCT02193074; NCT02292537); resultaterne forventes at foreligge i 2017.
Og selv om der endnu ikke er observeret nogen sikkerhedsproblemer ved brug af 2′-MOE i SMA-behandling, har der været forbundet nogle toksiciteter med 2′-MOE ASO’er i andre patientpopulationer.77,78 En anden backbone-modifikation, der undersøges til brug i SMA, og som kan omgå disse problemer, er phosphoroamidat morpholino-oligomerer (PMO’er). PMO’er har vist sig at være mere effektive end 2′-MOE i musemodeller af Duchenne muskeldystrofi (DMD), en anden pædiatrisk neuromuskulær sygdom, og blev også godt tolereret hos DMD-patienter.79 En ICV-injektion af morpholino ASO’er, der supplerer ISS-N1, forbedrede signifikant overlevelsen af SMA-mus uden tegn på toksicitet i centralnervesystemet (CNS).80,81 Et morpholino målrettet mod ISS-E1, en intronisk splejsningssilencer, der findes opstrøms for exon 7, forbedrer også fænotypen hos SMA-mus.82 Denne fremgangsmåde er endnu ikke blevet taget i klinikken.
Som følge heraf kan ASO’ernes kemi påvirke egnetheden til forskellige leveringsmetoder, nødvendigheden af gentagen dosering og give associerede toksiciteter – hvilket alt sammen har vigtige implikationer for den terapeutiske anvendelse. Desuden skal en ASO, der anvendes til behandling af SMA, forblive farmakologisk aktiv i væv i CNS, især i motoriske neuroner. Uanset hvilken backbone der er tale om, vil enhver ASO, der er udviklet til SMA-behandling, sandsynligvis skulle administreres direkte til cerebrospinalvæsken via intratekal injektion. Selv om nogle undersøgelser med perifer ASO-administration i neonatale mus viste effektivitet, er blod-hjernebarrieren ikke fuldt dannet hos unge mus, og en perifert administreret ASO er i stand til at trænge ind i CNS i en grad, der ikke er mulig hos mennesker.71 Det er opmuntrende, at ASO’er, der er injiceret intratekalt, har vist sig at fordele sig bredt blandt vigtige CNS-væv såsom motoriske neuroner, astrocytter og mikroglia.72,83-85
Og selv om intratekal injektion er noget invasiv og kræver sedation eller anæstesi, har ASO’er flere betydelige fordele i forhold til andre eksperimentelle modaliteter, herunder høj målspecificitet, bemærkelsesværdig effektivitet, lille toksicitet sammenlignet med systemisk tilførsel af ASO’er og relativt enkle fremstillingsprocesser sammenlignet med biologiske stoffer (men ikke små molekyler). Der findes flere oplysninger i kapitel 18.