Nukleinsyrer
Som mange andre biologiske molekyler er nukleinsyrer polymerer, lange molekyler, der består af gentagende enheder. I nukleinsyrer er den gentagende enhed nukleotidet. Et nukleotid består af et sukkerstof med fem kulstofatomer, en nitrogenholdig base og en fosfatgruppe. De to primære typer nukleinsyrer, desoxyribonukleinsyre (DNA) og ribonukleinsyre (RNA), har lidt forskellige sukkerarter i deres respektive nukleotider og et forskelligt sæt af fire baser, som kan være indeholdt i deres nukleotider.
 |
 |
| DNA Nukleotid | |
 |
|
| RNA-nukleotid | Strukturen af et afsnit af et RNA-molekyle. |
Bemærk tilstedeværelsen af en hydroxylgruppe på 2′-kulstoffet i sukkeret måy.
|
|
 |
 |
|
| Adenin – DNA og RNA |
Guanin – DNA og RNA |
Thymin –
DNA og RNA |
|
 |
 |
||
| Cytosin – – DNA og RNA |
|||
|
|
Uracil – Kun RNA |
Af stor betydning for elektroforese er ioniseringen af fosfatgrupperne, hvilket giver nukleinsyrerne en stor negativ nettoladning. Fordi hvert nukleotid er ioniseret, vil ladning/masseforholdet mellem to forskellige nukleinsyremolekyler være meget tæt på hinanden.
 |
 |
| Fosfatgrupperne i hvert nukleotid bærer en negativ formel ladning. Fordi hvert nukleotid bærer den samme ladning, er forholdet mellem ladning og masse i forskellige nukleinsyremolekyler næsten identisk. Elektrisk kraft får negativt ladede nukleinsyremolekyler til at vandre mod den positive pol. | |
DNA og RNA indeholder hver især fire mulige nukleotider, der svarer til sættet af fire mulige baser (adenin, guanin, thymin og cytosin for DNA; adenin, guanin, uracil og cytosin for RNA). Hver base har en særlig affinitet for en af de tre andre baser på grundlag af symmetrierne for hydrogenbindinger. Kvælstofbasen adenin “baseparrerer” sig med thymin (eller uracil i RNA). Guanin “baseparrerer” med cytosin. På grund af baseparring kan DNA eller RNA eksistere som enkeltstrengede eller dobbeltstrengede varianter. Den dobbeltstrengede form består af to komplementære strenge, der er forbundet ved baseparring.
Baseparring af to komplementære strenge gør det muligt for nukleinsyremolekyler at antage en dobbeltstrenget form.
Baseparring kan også forekomme i enkeltstrenget DNA eller RNA. En sektion, der indeholder en sekvens af nukleotider, vil ofte løkke tilbage og baseparre med en komplementær sektion på samme kæde. Dette vil påvirke molekylets 3-dimensionelle struktur, hvilket har betydning for elektroforiske separationer. Generelt findes lange DNA- eller RNA-strenge i en baseparret konformation, enten dobbeltstrenget eller enkeltstrenget med intern parring. Uparrede eller “denaturerede” nukleinsyrer findes kun i opløsning under særlige forhold, som destabiliserer baseparrene.
Baseparring er ikke begrænset til dobbeltstrengede varianter, men kan også forekomme inden for det samme molekyle. De resulterende konformationer kan føre til elektroforeseresultater, der er vanskelige at fortolke.
Elektroforese af dobbeltstrenget DNA eller RNA betegnes som native gelelektroforese. Elektroforese af enkeltstrenget DNA eller RNA sker under denaturerende forhold. Formamid og urinstof er de to mest almindelige midler, der udfører kemisk denaturering. Disse stoffer virker for at afbryde hydrogenbindingen mellem nitrogenbaserne og fjerner derved virkningerne af baseparring. Normalt anvendes en kombination af formamid, urinstof og varme under hele denatureringselektroforeseprocessen, fra prøveforberedelse til kørsel af gelen. Formålet med denatureringsbetingelserne er at sikre enkeltstrengede molekyler og at forhindre konformationsændringer som følge af baseparring mellem forskellige dele af det samme DNA- eller RNA-molekyle. Denaturerende elektroforeseforhold giver mulighed for et konsistent forhold mellem molekylestørrelse og mobilitet gennem gelen.
Formamid og urinstof opnår denaturering af DNA eller RNA ved at danne nye hydrogenbindinger med baserne i nukleinsyremolekylerne og afbryde de hydrogenbindinger, der fører til baseparring.
NÆSTE TEMA: Biologiske makromolekyler-Nukleinsyrer