Resultater og diskussion
Den “autofagiske flux”-assay beskrevet i Jiang et al. er en kvantitativ grøn fluorescerende protein (GFP)-reporterassay, der måler de ratiometriske ændringer af polyQ-GFP til frit GFP via Western Blot-analyse. Et multicistronisk reporterkonstrukt blev designet til at kode for to proteiner; polyQ knyttet til N-terminal GFP og fri GFP. Den virale 2A-sekvens (v2A) blev placeret som en linkerregion mellem de sekvenser, der koder for de to proteiner, for at muliggøre stoikiometrisk oversættelse af to separate proteiner fra én åben læseramme (fig. 1a) .
Generering af de formodede Q52-, Q31- og Q10-GFP-konstruktioner ved hjælp af det multikistroniske Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP-reporterkonstrukt. a Vektorkort over Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP-konstruktionen. b Oversigt over CAA- og CAG-degenererede kodonbrug i denne konstruktion. c Kromatografi af konstruktionen, der viser de tilfældigt interspacede glutamin-kodende CAG- og CAA-tripletter. d Skematisk illustration af PCR-baseret udelukkelsesamplifikation af den Q80-GFP-holdige konstruktion med henblik på at generere polyQ-konstruktioner med et lavere antal glutaminrepeats. e Q80-sekvens, der viser Q52-, Q31- og Q10-primerbindingsstederne. f Sekvenser af primere, der er beregnet til at generere Q52-, Q31- og Q10-konstruktioner. g Analytisk agarosegelelektroforese for hver af de formodede Q80-, Q52-, Q31- og Q10-vektorer ved hjælp af primere, der flankerer polyQ-regionen. Der blev set PCR-produktstørrelser på henholdsvis ~ 270, ~ 180, ~ 120 og ~ 60 bp for de påtænkte putative Q80-, Q52-, Q31- og Q10-GFP-konstruktioner
Vi designede en polyQ-sekvens, der indeholder 80 glutamin-repeats (Q80). Sekvensen blev designet til at have lav gentagelseslignende lighed ved tilfældigt at interspacing glutamin-kodende CAG-tripletter med glutamin-kodende CAA-tripletter (Fig. 1b, c). Nukleotidudskiftningerne blev foretaget med øjnene for at skabe et halvt tilfældigt mønster. Dette ikke-repetitive sekvensdesign skulle ikke blot øge sekvensstabiliteten under opformering i bakterier, men gjorde det også muligt at designe PCR-printere, der annealerede til specifikke regioner i sekvensen.
Den ovenfor beskrevne Q80-GFP-v2A-GFP-konstruktion blev syntetiseret kommercielt (Biomatik Corporation) (se Additional file 1) og subklonet via BamHI- og ClaI-restriktionsstederne i den Tol2 transposon-baserede pT2AL200R150G-genoverførselsvektor (i det følgende benævnt Tol2), der fås fra Kawakami laboratoriet (Fig. 1a og se Additional file 2).
PolyQ-konstruktioner med et lavere antal glutaminrepeats blev genereret ved PCR-baseret udelukkelsesamplifikation af Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP-konstruktionen. Primerne blev designet til at amplificere omkring vektoren med udelukkelse af et defineret antal glutaminrepeats for at generere de konstruktioner af interesse (Fig. 1d-f). Vi tilstræbte at generere vektorer med ca. 52 (Q52), 31 (Q31) og 10 (Q10) glutaminrepeats. De formodede Q52- og Q31-vektorer blev genereret ved hjælp af den samme omvendte primer koblet med forskellige fremadrettede primere. Denne fælles omvendte primer forstærkede 2 glutaminrepeats, mens fremadrettede primere forstærkede de yderligere 50 og 29 glutaminrepeats, der var nødvendige for at generere henholdsvis Q52- og Q31-vektorerne. Den omvendte primers position blev forskudt en smule for at optimere amplifikationen af den formodede Q10-vektor, således at den omvendte primer nu forstærkede 5 glutaminreps, mens den fremadrettede primer forstærkede de resterende 5 glutaminreps (fig. 1d-f). Ved at anvende stringente annealingstemperaturer i PCR-reaktionen opnåede vi specifik primerbinding. Gelekstraherede og oprensede PCR-produkter blev fosforyleret, cirkulæriseret ved selvligering og efterfølgende transformeret til kompetente celler (se yderligere fil 3). PCR med primere, der flankerede polyQ-regionen, viste nogenlunde de forventede produktstørrelser for de påtænkte putative Q52-, Q31- og Q10-vektorer (fig. 1g). De genererede konstruktioner blev sekventeret for at fastslå, om de forventede polyQ gentagelsesnumre var til stede. Mens Q52-konstruktionen havde det forventede antal glutaminrepeats (fig. 2a, b), afslørede sekventeringen mindre afvigelser i forhold til det forventede polyQ-tal for de to andre konstruktioner, hvor Tol2-Q31-GFP-v2A-GFP-vektoren havde 21 glutaminrepeats (i det følgende benævnt Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP) (fig. 2c, d) og Tol2-Q10-GFP-v2A-GFP-vektoren havde 11 glutaminrepeats (i det følgende benævnt Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP) (fig. 2e, f) (fig. 2e, f). Yderligere analyse viste, at den genererede Q21-sekvens var afledt direkte fra den oprindelige sekvens, og at tabet af glutaminrepeats skyldtes, at Q31-forwardprimeren bandt 30 bp nedstrøms fra det forudsagte bindingssted. I modsætning hertil blev den ekstra glutamin gentagelse i Q11 sekvensen genereret de novo, en tilføjelse af et CAA codon.
Vektorkort og sekvensanalyse af de konstrukter, der koder for Q52, Q21 og Q11-GFP, genereret ved PCR-baseret excisionsamplifikation. a Vektorkort af Tol2-Q52-GFP-v2A-GFP-konstrukt. b Kromatografi af Q52-konstrukt. c Vektorkort over Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP-konstruktionen. d Chromatograf af Q21-konstruktionen. e Vektorkort over Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP-konstruktionen. f Chromatograf af Q11-konstruktionen
For at studere aggregationskinetikken og “autofagisk flux” af polyQ-protein in vivo injicerede vi de genererede polyQ-vektorer (25 ng/μL) og transposase-mRNA (25 ng/μL) i grupper af zebrafiskembryoner i et cellestadie (fig. 3a, b). Western blot-analyse med anti-GFP-antistof af 24 h efter befrugtning (hpf) embryolysater (10 embryoner pr. prøve) blev udført for hver gruppe. Den tomme Tol2-vektor (25 ng/μL) og transposase mRNA (25 ng/μL) injicerede og ikke-injicerede embryoner blev inkluderet som kontroller. Embryoner, der blev injiceret med polyQ-konstruktionerne, producerede som forventet to bånd, der blev påvist af anti-GFP-antistoffet; GFP bundet til polyQ (polyQ80-GFP ved ~ 48 kDa, polyQ52-GFP ved ~ 38 kDa, polyQ21-GFP ved ~ 33 kDa og polyQ11-GFP ved ~ 31 kDa) og fri GFP (~ 27 kDa) (fig. 3c). Hvert af de polyQ-GFP-konstruktudtrykkende embryolysater viste også et svagere bånd af højere proteinstørrelse svarende til polyQX-GFP-v2A-GFP-konstruktet i fuld længde (polyQ80-GFP-v2A-GFP ved ~ 75 kDa, polyQ52-GFP-v2A-GFP ved ~ 65 kDa, polyQ21-GFP-v2A-GFP ved ~ 60 kDa og polyQ11-GFP-v2A-GFP ved ~ 58 kDa). Dette bånd repræsenterer de ~ 10 % af det samlede protein, der oversættes som et enkelt, fuldlængdeprotein ved brug af v2A-sekvenssystemet . Q80-GFP:GFP, Q52-GFP:GFP, Q21-GFP:GFP og Q11-GFP:GFP-forholdet er henholdsvis ~ 5, ~ 4, ~ 2 og ~ 1 (fig. 3d). Da v2A-sekvensen muliggør en stoikiometrisk oversættelse af polyQ-GFP- og GFP-proteinerne, burde polyQ-GFP:GFP-forholdet i teorien være 1. De større forhold, der er observeret, kan indikere en ophobning af disse proteiner. Disse observationer er i overensstemmelse med litteraturen, hvor det er blevet vist, at polyQ-GFP-fusionskonstruktioner med mere end 19 glutaminrester aggregeres i transficerede celler på en længdeafhængig måde . Disse observationer får os til at konkludere, at vores Tol2-QX-GFP-v2A-GFP-konstruktioner er et nyttigt redskab til at studere “autofagisk flux” in vivo i en larval zebrafiskmodel.
Analyse af Tol2-QX-GFP-v2A-GFP-konstruktets ekspression i D. rerio. Zebrafiskembryoner blev injiceret med 25 ng/µL af Tol2-QX-GFP-v2A-GFP-konstruktionen og 25 ng/µL mRNA, der koder for Tol2-transposase. a Lysfeltsbilleder (øverste paneler) og fluorescerende billeder (nederste paneler) af venstre sidevisning af zebrafiskembryohoved- og -stammeområder, der udtrykker Q80, Q52, Q21 og Q11-GFP, ~ 24 hpf. b Lysfeltsbilleder (øverste paneler) og fluorescerende billeder (nederste paneler) af venstre side af zebrafiskembryoens bagkrop og haleområder, der udtrykker Q80, Q52, Q21 og Q11-GFP, ~ 24 hpf. c Western Blot-analyse af ekspressionen af Qx-GFP-konstruktioner i D. rerio. Proteiner blev isoleret fra ~ 24 hpf embryoner, der udtrykker Q80-, Q52-, Q21- og Q11-GFP-konstruktionerne. Proteinerne blev opløst på en 10% SDS-PAGE-gel og overført til en nitrocellulosemembran. Membranen blev undersøgt med et anti-GFP-antistof. Den “tomme” Tol2-vektor har et udtrykt GFP-gen, der udskiftes under indsættelse af konstruktet. d Western Blot-kvantificering. GFP-intensiteten for hvert nummereret bånd på Western Blot og Qx-GFP-forholdet til fri GFP præsenteres
Konklusion
Sammenfattende giver denne undersøgelse en robust og let anvendelig løsning til at generere polyQ-repeats af en længde tæt på den tilsigtede længde. For at generere et nøjagtigt antal glutaminrepeats kan der foretages efterfølgende amplifikationsrunder med ændrede primersekvenser. Desuden kan primerlængden øges for at øge specificiteten af primerens annealing til skabelonen. Vores teknik har flere fordele i forhold til de eksisterende metoder til PCR-baseret amplifikation af repetitive regioner og sigter mod at minimere genereringen af uspecifikke PCR-produkter og fejlbehæftede gentagelser ved at udnytte den genetiske kodes kodonredundans til at generere en synonym DNA-kodningssekvens med reduceret gentagelse. Desuden er vores fremgangsmåde ikke begrænset til at generere polyQ-repeterede sekvenser, men kan også generaliseres til at generere andre nukleotid-repeterede sekvenser. Desuden er vores metode relativt billig, da kun det indledende polyQ80-GFP-v2A-GFP-konstrukt kræver kommerciel syntese, hvis pris afhænger af prisen pr. nukleotidbase, længde, renhed og masse. Alle andre materialer, der kræves, er standardreagenser, der anvendes til molekylær kloning. Sammenfattende giver den beskrevne teknik en let anvendelig og økonomisk overkommelig løsning til at generere gentagelseskodende DNA-sekvenser, der kan manipuleres efter behov.