Findelse af en effektiv måde at hæmme immune afstødninger på er en af de vigtigste strategier til støtte for kliniske transplantationer. For nylig viste undersøgelser vedrørende organtransplantation, at anvendelsen af DPPIV-hæmmer eller anti-CD26 mAb henholdsvis øgede engraftningen af donorceller og mindskede akut GVHD og indikerede CD26 som et nyt mål for terapeutisk intervention i GVHD-sygdom.11 For at klarlægge CD26’s rolle i allogen transplantationsafstødning blev der anvendt CD26 knockout-mus i en undersøgelse af allogen hudtransplantation. Vi fandt, at CD26-/- mus præsenterede en lavere nekrotisk grad af transplantater og forsinket allograft afstødning (Fig. 1).
CD26 er en aktiveringsmarkør for T- og B-lymfocytter og NK-celler. Som et kostimulerende molekyle medierer CD26 T-celle signaltransduktionsprocesser gennem interaktion med adenosindeaminase, CD45, caveolin-1 eller CARMA1.5 Blokade af CD26-medieret T-celle co-stimulering inducerede anergi i CD4+ T-celler.24 I det foreliggende arbejde blev der fundet en lavere procentdel CD3+ såvel som CD4+ celler i MPBL’er og MSL’er hos CD26-/- mus både før og efter hudtransplantation (Fig. 3). Desuden blev der påvist infiltration af CD3+ og CD4+ celler i lavere grad i transplantatvævet hos CD26-/- mus end hos CD26+/+ mus efter hudtransplantation (Fig. 7b, c). Dette fund indikerer, at CD26-mangel resulterer i nedsat udvikling, modning og funktion af CD4+-celler, hvilket svarer til vores tidligere fund.23 Interessant nok var procentdelen af CD8+-celler i MPBL’er af CD26-/- mus den samme som i CD26+/+ mus før transplantation; procentdelen var dog signifikant lavere i CD26-/- end i CD26+/+ mus efter hudtransplantation (Fig. 3). Infiltrationsantallet af CD8+ celler i hudtransplantationerne var klart lavere hos CD26-/- end hos CD26+/+ mus efter hudtransplantation. Disse resultater tyder på nedsat proliferation, aktivering og funktion af CD8+ celler i CD26-/- mus som reaktion på allogene antigener. CD8+ T-celler er en fremtrædende komponent af det allogene T-celle repertoire, der induceres efter allogen transplantation hos mus; deres cytotoksiske aktivitet er rettet mod donor-major histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I-peptider.25 Den reducerede procentdel af CD8+ celler i CD26-/- mus (Fig. 3) efter allogen transplantation kan delvis bidrage til den reducerede nekrotiske grad af transplantater og forsinket allograft afstødning. Desuden var procentdelen af CD3+, CD4+ og CD4+NK1.1- celler i MSL’er lavere i CD26-/- mus end i CD26+/+ mus før transplantation, men forskellen blev reduceret efter transplantation. Det blev rapporteret, at hæmning af CD26 øgede homing af donorceller og forbedrede allogen engraftment.26 Faldet i den procentvise forskel i procentdel af CD3+ og CD4+ celler af MSL’er mellem de to musetyper efter transplantation kan skyldes den øgede homing af disse celler til milten hos CD26-/- mus.
Allograft afstødning er primært drevet af værtens T-celler. Selv om alle komponenter af det medfødte og adaptive immunsystem deltager i afstødning af transplantater, er T-lymfocytter og især CD4+ celler af afgørende betydning i denne proces.27 Når de først er aktiveret, styrer CD4+ T-cellerne primært udviklingen af responsen ved at udskille cytokiner, der aktiverer, ekspanderer og/eller rekrutterer andre effektorceller, såsom makrofager, CD8+ T-celler og B-celler.27, 28 Ved yderligere analyse af cytokinniveauer i begge typer mus blev der fundet en markant reduceret sekretion af IL-2, IFN-γ, IL-6, IL-17, IL-4 og IL-13 i serumet fra CD26-/- mus efter allogen transplantation (fig. 4). Denne reducerede sekretion kan være forårsaget af et lavere antal CD4+ celler i CD26-/- musene før transplantationen; der bør dog tages hensyn til nedsat differentiering og funktion af CD4+ celler som respons på det allogene antigen i CD26-/- musene. Lave serumniveauer af IL-2, IFN-γ og IL-6 indikerer delvis defekt differentiering og funktion for Th1-celler, mens lave niveauer af IL-4 og IL-13 indikerer utilstrækkelig differentiering og funktion af Th2-celler i CD26-/- mus.
Som et nøglecytokin udviser IFN-γ forskellige og potentielt modstridende virkninger på afstødning af organallotransplantater.29 IL-2 er et andet Th1-associeret cytokin, som også har komplekse virkninger på afstødning af allotransplantater.30 Både IFN-γ og IL-2 er plejotrope cytokiner og spiller en vigtig rolle i proliferationen af T- og B-celler under den inflammatoriske reaktion. Cytokinerne virker først som molekyler, der initierer T-cellevækst og overlever under immunresponset og forstærker derefter Th1-responset med positiv feedback.29, 30 Ved akut afstødning infiltrerer Th1-cellerne overvejende ind i transplantater, hvor IL-2 og IFN-γ kan inducere aktivering af NK-celler og makrofager, som er stærke våben til at ødelægge allografts.29, 30 Endvidere inducerer IFN-γ ekspression af klasse II MHC-molekyler og sekretion af IgG2a og IgG3 fra aktiverede B-celler. I en akut afstødningsmodel viste IFN-γ-/- mus forsinket afstødning af hudtransplantater.31 Flere undersøgelser har rapporteret, at tolerance over for afstødning af allotransplantater i det mindste delvist formidles af IL-4, et typisk cytokin for Th2-celler, ved at fremme IL-10 og IgG1-produktion.32 Andre undersøgelser har givet modstridende resultater, der indikerer, at administration af Th2-hæmmer forlænger overlevelsen af hjerteallotransplantater.33 IL-13, som viser virkninger svarende til IL-4, er et andet cytokin, der er forbundet med Th2-responset; IL-13 deler en receptorkæde (IL-4R α-kæde) med IL-4, men adskiller sig i de involverede målceller, hvilket resulterer i en række forskellige biologiske hændelser.32 Et stigende antal undersøgelser har vist, at cytokiner fra både Th1- og Th2-celler, såsom IL-2, IFN-γ og IL-4, er i stand til at understøtte B-celleklonale ekspansion og antistofsyntese.28, 34 CD26-mangel resulterer i nedsat differentiering og funktion af Th1- og Th2-celler i CD26-/-mus. Lave niveauer af Th1-cytokinerne IFN-γ og IL-2 kunne resultere i et fald i proliferation af CD8+-celler (Fig. 3) og aktivering af makrofager, hvorved infiltrationen af CD8+-celler og makrofager i transplantater (Fig. 7) under afstødning af allotransplantater reduceres (Fig. 7). På den anden side kunne lave niveauer af IFN-γ, IL-2 og IL-4 i CD26-/- mus efter allogen transplantation forringe aktiveringen og differentieringen af B-celler, hvilket reducerede antistofproduktionen (Fig. 2).
Immune afstødning er en kompleks proces, der involverer et cellulært såvel som et humoral immunrespons og er karakteriseret ved produktion af antistoffer af B-lymfocytter. IgG, der er hovedkomponenten i serum-Igs og et almindeligt patogent antistof hos patienter med transplantationsafstødning, spiller en uundværlig rolle i forbindelse med beskadigelse af transplantater under transplantationsafstødning.35 I vores nuværende arbejde blev der påvist en lav produktion af IgG og dets undergrupper, IgG1 og IgG2a, i serum fra CD26-/-mus (Fig. 2). Dette resultat svarer til vores tidligere resultater, der viser, at antistofproduktionen var klart lavere i CD26-/- mus end i CD26+/+ mus enten efter ovalbumin immunisering eller efter pokeweed mitogen stimulering.23, 36 Dette resultat indikerer, at differentieringen af B-celler blev forringet af CD26-mangel. Ved T-celleafhængig B-celleaktivering er der behov for et samspil mellem B-celler og Th-celler og visse cytokiner fra Th1 og Th2 for at understøtte B-celleklonale ekspansion og antistofsyntese. Hos CD26-/- mus kunne en lav procentdel Th-celler (CD4+) (fig. 3) og en lav produktion af IL-2 og IL-4 (fig. 4) føre til nedsat aktivering og differentiering af B-celler og dermed nedsat IgG-produktion. IgG er en vigtig komponent, der medierer allorekognition mellem eksogene antigener og modtagerens CD8+ celler under afstødning af transplantatet.37 Lav IgG-produktion hos CD26-/-mus (Fig. 2) kan derfor resultere i en reduktion af transplantatangreb fra effektorceller.
Interessant nok var sekretionsniveauet af IL-10 højere hos CD26-/-mus (Fig. 4G). CD26/DPPIV-blokade, der understøtter vores resultater, har vist sig at forbedre lungeallotransplantation og øge ekspressionen af IL-10.38 IL-10 er kendt for at være et antiinflammatorisk cytokin; IL-10 er blevet rapporteret for at nedregulere ekspressionen af Th1- og Th17-cytokiner i inflammationsprocessen, især under Treg-celle-signalering.39 Forskellige celletyper producerer IL-10, herunder Th2- og makrofager samt regulatoriske T-celler.40 I CD26-/-musene kan de høje niveauer af IL-10-sekretion (fig. 4g) være et resultat af en høj procentdel Tregs (fig. 6). Især blev der som reaktion på allogen transplantation påvist høje niveauer af IL-6 i serum fra CD26+/+-musene fra den første dag og toppede på dag 7 efter transplantation; derimod blev der kun påvist en lille mængde IL-6 i serum fra CD26-/–musene indtil dag 7 efter transplantation (Fig. 4d). Nylige undersøgelser har vist, at IL-6 spiller en meget vigtig rolle i reguleringen af balancen mellem IL-17-producerende Th17-celler og Tregs.41 Det lave niveau af IL-17 og den høje procentdel Tregs, der blev observeret hos CD26-/- mus i denne undersøgelse (fig. 5 og 6), kunne således delvis skyldes nedsat IL-6-funktion og overskydende IL-10-aktivitet.
Det er desuden blevet rapporteret, at humane Th17-celler er karakteriseret ved højt udtryk af CD26,18 som er en negativ selektionsmarkør for humane Tregs,19 hvilket tyder på, at CD26 er involveret i differentiering og funktion af Th17-celler, men ikke er relateret til Tregs. Det er derfor ikke overraskende, at der blev observeret en forringet balance i differentieringen af Th17- og Tregs-celler hos CD26-/- mus. Selv om afstødning af allotransplantater traditionelt er forbundet med Th1-differentiering, viste mange nyere undersøgelser, at Th17-celler og IL-17 var tæt forbundet med afstødning af allotransplantater.42 Th17-celler er en nyere tilføjelse til T-celleparadigmet, mens IL-17, et centralt Th17-cytokin, er en proinflammatorisk faktor.43 Akkumulerende beviser tyder på, at Th17-celler spiller en rolle i udviklingen af kronisk allotransplantationsskade ved transplantation af forskellige organer. Kendetegnende for Th17-cellemedieret allograft-afstødning er IL-17’s evne til at rekruttere neutrofiler, som er en af de første inflammatoriske effektorceller, der er i stand til at infiltrere allograftet efter transplantation og derved forårsage allograftskader.42 Omvendt spiller Tregs en afgørende rolle i immuntolerance og negativ kontrol af forskellige immunresponser gennem undertrykkelse eller nedregulering af andre effektor-T-celler under immunafstødning.44 Det blev rapporteret, at hæmning af CD26/DPPIV fremmer sekretionen af TGF-β1, som er afgørende for differentiering af Tregs.45 For udvikling og funktion af CD4+CD25+ Treg-celler kræves forkhead-transskriptionsfaktor (Foxp3).46 IL-10 rapporteres at være en vigtig faktor for opretholdelse af FoxP3-ekspression.47 Det høje niveau af IL-10, der blev observeret i CD26-/- mus (Fig. 4g), kan have været til gavn for ekspressionen af FoxP3. Den reducerede Th17-aktivitet og den øgede Tregs-procentdel i MSL’er og MPBL’er hos CD26-/- mus efter allogen transplantation antages at være den vigtigste årsag til den reducerede nekrose af transplantatet og den forsinkede afstødning af allotransplantatet hos CD26-/- mus.
Visse kemokiner bidrager til infiltration af makrofager i transplantatvæv, såsom monocytkemotaktisk protein (MCP-1, -2, -3), makrofagkoloni-stimulerende faktor (M-CSF eller CSF-1) og kemokinligand 5 (CCL5 eller RANTES (regulated and normal T cell expressed and secreted)).48 Som substrater for DPPIV/CD26 kan MCP’er og RANTES trunkeres af DPPIV, hvorefter deres kemotaktiske egenskaber ændres.3 Det blev fundet, at MCP med en amino-terminal Lys kan spaltes af CD26/DPPIV og kan resultere i inaktivering af dens kemotaksi; MCP med en NH2-terminal pGlu forblev imidlertid upåvirket.49 Virkningen af CD26 på de forskellige isoformer af MCP involveret i makrofag kemotaksi under hudtransplantation bør undersøges nærmere. Trunkering af CCL5/RANTES med DPPIV blev rapporteret til at mindske dens binding til kemokinreceptor 1 (CCR1) og CCR3, men øgede dens binding til CCR5, hvilket bidrog til rekruttering af makrofager i nyretransplantater.48 CD26-mangel hos CD26-/-mus reducerede sandsynligvis aktiviteten af CCL5/RANTES-binding til CCR5 og resulterede i en reduktion af makrofaginfiltrering i transplantater.
CD26 er et multifunktionelt protein, der enten udviser enzymatisk aktivitet eller interagerer med forskellige molekyler. Nylige undersøgelser har rapporteret, at CD26/DPPIV er involveret i kutan sårheling. Der blev observeret en højere grad af sårlukning, revaskularisering og celleproliferation hos CD26-/- mus, og DPPIV-hæmmer viste en potentiel fordel ved sårheling.50 I tilfælde af hudtransplantation er CD26 ikke kun involveret i immunafstødning, men også i sårhelingsprocessen; CD26 spiller således en Janus-lignende rolle i engraftment og afstødning. I det foreliggende arbejde var nekroticitetsniveauet i transplantaterne og niveauet af IgG og relaterede cytokiner i serumet hos CD26-/- mus markant lavere end hos CD26+/+-mus. Fra dag 13 efter transplantationen blev transplantaterne imidlertid fjernet, og sårene helede hurtigt hos CD26-/–musene. Reduktionen af allograft-afstødning hos CD26-/- mus, som observeret i vores nuværende arbejde, kan delvis modvirkes af en forbedring af sårheling, hvor CD26 er involveret i begge processer.
Sammenfattende tyder vores resultater på, at CD26 er involveret i allogen afstødning af allogene transplantater. CD26-mangel resulterede i delvis nedsat differentiering af Th1-, Th2- og Th17-subpopulationer, men øgede procentdelen af Tregs. Til gengæld påvirkede reducerede funktioner af Th1, Th2 og Th17 differentieringen af B-celler og nedsatte aktiviteterne af CD8+ celler og makrofager, hvilket førte til lavere produktion af IgG’er og forsinket allograft afstødning i CD26-/-mus.