Skematisk diagram over domænestruktur af humane IAP-proteiner. BIR, Baculovirus IAP-repeats; CARD, caspase-aktiverende og rekrutteringsdomæne; RING, ring-zinkfinger.
Den fysiologiske mitokondriefunktion af Smac/DIABLO er ukendt, og DIABLO -/- mus synes normale (Okada et al., 2002). Selv om in vitro-spaltningen af procaspase-3 ved tilsætning af cytochrom c blev hæmmet i lysater af Smac -/- celler, reagerede Smac -/- mus og celler normalt på apoptotiske stimuli såsom UV-stråling, staurosporin, etoposid og TNF/cyclohexamid (Okada et al., 2002). Disse observationer tyder på, at der findes redundante faktorer, der kompenserer for tabet af Smac/DIABLO, muligvis HtrA2/OMI.
Omi/HtrA2 er et kernekodet, 49 kDa protein med et N-terminalt mitokondrie-lokaliseringssignal, der medierer dets translokation ind i det mitokondrielle intermembranrum (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). Omi/HtrA2 behandles i intermembranrummet til den modne 37 kDa form, idet der frigives en IBM ved dens N-terminus (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002) (Tabel 1). Selv om rekombinant Omi/HtrA2 kan katalysere sin egen modning in vitro, er den protease, der er ansvarlig for dens modning i celler, stadig ukendt (Martins et al., 2002). Omi/HtrA2 spiller en væsentlig rolle i reguleringen af mitokondriel homeostase, hvilket kræver dens proteolytiske aktivitet, selv om de molekylære mål og interaktionspartnere for Omi/HtrA2 i mitokondriet endnu ikke er blevet defineret (Saelens et al., 2004). Når Omi/HtrA2 frigives fra mitokondrier til cytosolen, fremmer den celledøden på en caspaseafhængig måde ved at antagonisere IAP’er og på en caspaseuafhængig måde som protease (Saelens et al., 2004). I lighed med Smac/DIABLO blokerer Omi/HtrA2 IAP’er gennem sit N-terminale IAP-bindende motiv, der præsenteres i en trimerisk konfiguration (Li et al, 2002)
Og selv om frigivelsen af cytokrom c i cytosolen direkte udløser caspase-3-aktivering gennem dannelse af det cytokrom c/Apaf-1/caspase-9-holdige apoptosomkompleks, fremmer Smac/DIABLO og Omi/HtrA2 indirekte caspaseaktivering gennem antagonisering af de inhiberende virkninger på IAP’er (Saelens et al., 2004). Der eksisterer således en dynamisk ligevægt mellem pro- og antiapoptotiske effektormolekyler, som gør det muligt for cellen at klare begrænsede mitokondrielle skader, hvor IAP’er på passende vis kan blokere caspaseaktivering, der er initieret af en lille mængde frigivet cytochrom c. Under omstændigheder, hvor mitokondriel skade fortsætter eller samtidig påvirker flere mitokondrier, kan den antiapoptotiske hurdle, som IAP’erne udgør, imidlertid overvindes af den højere cytosoliske koncentration af deres antagonister Smac/DIABLO og HtrA2/OMI, som neutraliserer IAP’erne ved direkte binding.
Der er stadig flere beviser for, at kræftceller har en intrinsisk drivkraft til apoptose, som holdes i skak af IAP’erne. Til dette formål blev der påvist høje basale niveauer af caspase-3- og caspase-8-aktiviteter og aktive caspase-3-fragmenter i fravær af apoptose i forskellige tumorcellelinjer og kræftvæv, men ikke i normale celler (Yang et al., 2003a). Tumorceller, men ikke normale celler, udtrykte også høje niveauer af IAP’er, hvilket tyder på, at opreguleret IAP-ekspression modvirkede den høje basale caspaseaktivitet selektivt i tumorceller (Yang et al., 2003a). Derfor betragtes strategier, der er rettet mod IAP’er, som en lovende metode til at øge effektiviteten af cytotoksiske terapier selektivt i kræftceller. Med henblik herpå sænkede transfektionsforceret ekspression af Smac/DIABLO tærsklen for TRAIL-induceret dræning i forskellige tumorer (Ng og Bonavida, 2002; Okano et al., 2003) og sensibiliserede også kræftceller for kemoterapi (McNeish et al., 2003; Zhao et al., 2006). Translokation af endogen Smac/DIABLO til cytosolen under kræftlægemiddelinduceret apoptose synes imidlertid ikke at spille en væsentlig rolle under visse betingelser, f.eks. i humane lungekarcinomceller efter behandling med etoposid (Bartling et al., 2004). Nedregulering af Smac/DIABLO ved hjælp af små interfererende RNA (siRNA) havde ingen indflydelse på aflivning ved etoposid i disse celler, selv om et IAP-bindende peptid Smac-N7 øgede etoposid-induceret apoptose (Bartling et al., 2004). Disse data tyder på, at Smac/DIABLO-mangel kan kompenseres af virkningen af redundante determinanter i visse kræftceller.
Mitokondrielle mediatorer af caspase-uafhængig apoptose
Når HtrA2/OMI frigives fra det mitokondrielle intermembranrum, bidrager HtrA2/OMI til celledøden også på en caspase-uafhængig måde som protease ud over at fremme apoptose på en caspase-afhængig måde ved at antagonisere IAP’er (Suzuki et al, 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). In vitro-data viste nedbrydning af XIAP, cIAP1, cIAP2 og Apollon ved proteaseaktivitet af HtrA2/OMI (Suzuki et al., 2004). Desuden påviste Trencia et al. (2004) interaktionen mellem antiapoptotisk PED/PEA-15 og det cytosoliske HtrA2/OMI og dets nedbrydning af det. Nedsættelse af niveauerne af HtrA2/OMI i celler ved antisense- eller RNA-interferens nedsætter forskellige kræftcellelinjeres følsomhed over for celledød induceret af staurosporin, Fas, UV eller cisplatin (Martins et al, 2002).
Dertil kommer, at AIF og endonuklease G frigives fra mitokondrier ved permeabilisering af den ydre mitokondriemembran og translokaliseres ind i kernen for at bidrage til nukleær kromatinkondensering og DNA-fragmentering i stor skala (Cande et al., 2004; Saelens et al., 2004). Hvorvidt disse to proteiner frigives før, sammen eller efter cytochrom c er blevet diskuteret kontroversielt (Arnoult et al., 2002). Det er heller ikke helt klart, hvordan AIF bidrager til nukleær DNA-fragmentering, da det mangler iboende DNase-aktivitet. I pattedyrceller samarbejder cyclophilin A, en peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, med AIF for at inducere nedbrydning af DNA (Cande et al., 2004).
Disruption af den intrinsiske vej i cancer
Mutationer i gener, der er involveret i reguleringen af den mitokondrielle vej, er meget almindelige i cancerceller. Da de fleste kræftbekæmpende behandlinger inducerer apoptose i kræftceller ved at udløse den intrinsiske vej, er sådanne mutationer normalt forbundet med behandlingsresistens. F.eks. er overekspression af Bcl-2 som følge af kromosomal translokation af bcl-2 onkogenet til immunglobulin tunge kæde genlokus forbundet med ca. 85 % af de humane follikulære lymfomer (Tsujimoto et al., 1984). Forsøg med transgene mus har vist, at overekspression af Bcl-2 kan fremme neoplastisk transformation af B- og T-lymfocytter og myeloide celler (McDonnell og Korsmeyer, 1991; Traver et al., 1998).
I betragtning af, at overekspression af antiapoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien fremmer onkogenese, følger det, at proapoptotiske medlemmer af denne familie med multi BH-domæne fungerer som tumorsuppressorer. Da Bax og Bak imidlertid har stort set overlappende roller i apoptose, har det været vanskeligt at afgøre, om denne hypotese holder stik, og faktisk er bax-/- mus ikke markant disponeret for neoplasi (Knudson et al., 2001). Der er imidlertid fundet somatiske mutationer, der inaktiverer bax-genet, i visse solide tumorer og hæmatologiske maligniteter. I den forbindelse er der beskrevet enkelt nukleotid-substitutioner eller frameshift-mutationer, som inaktiverer Bax-genet i mismatch repair-deficient (MMR) tyktarmskræft eller hæmatopoetiske maligniteter (Rampino et al., 1997; Kitada et al., 2002).
Der er desuden stigende beviser for, at BH3-only-proteiner kan bidrage til undertrykkelse af malign transformation, hvilket indikerer, at de kan fungere som bona fide tumor-suppressorer. F.eks. blev det vist, at tab af en enkelt allel af Bim fremskynder B-celle lymfomagenese induceret af ekspression af en c-myc transgen (Egle et al., 2004), hvilket er i overensstemmelse med Bims nøglerolle som regulator af lymfoid homeostase (Strasser, 2005). Interessant nok er der for nylig blevet identificeret homozygote deletioner i den kromosomale region, der huser bim-genet, hos patienter med mantelcellelymfom (Tagawa et al., 2005). Mus, der mangler bid, udvikler spontant en myeloproliferativ lidelse, der kan udvikle sig til en malignitet, der ligner kronisk myelomonocytær leukæmi (CMML) (Zinkel et al., 2003). Desuden blev RNAi-medieret undertrykkelse af Puma rapporteret til at fremskynde Myc-induceret lymfomagenese (Hemann et al., 2004).
Ud over genetiske ændringer reguleres aberrant ekspression af Bcl-2-familieproteiner for det meste på transkriptionelt eller post-transkriptionelt niveau. F.eks. er ekspression af flere antiapoptotiske Bcl-2-familieproteiner, f.eks. Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 eller Bfl-1, transkriptionelt reguleret af NF-κB (Cory og Adams, 2002).
Suden Bcl-2-familieproteiner blev nedsat eller fraværende aktivitet af Apaf-1 fundet i æggestokkræft, melanom og leukæmi. Desuden indvirker mutationer i tumorsuppressor-genet p53, den mest almindelige genetiske defekt i menneskelige kræftformer, på den intrinsiske vej. For eksempel opregulerer aktivering af p53 en række gener, der har p53-responsive elementer i deres promotorer, såsom de proapoptotiske BH3-proteiner Puma, Noxa og Bid (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Som følge heraf er celler, hvor p53 er stabiliseret, følsomme over for aktivering af den mitokondrielle celledødsvej. Desuden kan p53 påvirke mitokondrieintegriteten direkte uden behov for genaktivering. Det er nemlig blevet rapporteret, at p53 kan binde sig til Bcl-2 og Bcl-XL ved mitokondrierne og derved fremme mitokondriel destabilisering (Mihara et al., 2003).
Signalering gennem den intrinsiske vej i kræftbehandling
De fleste konventionelle kemoterapeutiske midler, f.eks. etoposid, doxorubicin, cisplatin eller paclitaxel, fremkalder mitokondriel permeabilisering på en indirekte måde ved at udløse forstyrrelser af det intermediære stofskifte eller ved at øge koncentrationen af proapoptotiske second messengers, f.eks. ved at inducere p53-ekspression, ved at inducere ceramid/GD3-vejen, ved at inducere CD95/CD95L-ligand-systemet, ved at påvirke Bcl-2-lignende proteiner og/eller ved at kompromittere redox- eller energibalancen.
Der er flere og flere beviser for, at der findes et nukleo-mitokondrie-transmissionsnetværk efter DNA-skader. For eksempel kan apoptotiske signaler som følge af DNA-skader overføres via tumorsuppressoren p53 til mitokondrier, som igen frigiver apoptogene faktorer i cytoplasmaet, der aktiverer nedstrøms destruktionsprogrammer (Moll et al., 2005). p53 kan indirekte engagere den mitokondrielle vej ved transkriptionelt at aktivere ekspressionen af proapoptotiske Bcl-2-proteiner, f.eks. Bid, Puma eller Noxa (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Desuden kan p53 direkte udløse permeabilisering af den ydre mitokondriemembran på en transkriptionsuafhængig måde gennem direkte aktivering af de proapoptotiske Bcl-2-proteiner Bax eller Bak eller gennem binding og inaktivering af antiapoptotiske Bcl-2-proteiner såsom Bcl-2 eller Bcl-XL (Mihara et al., 2003; Chipuk et al., 2004; Moll et al., 2005). Det er vigtigt at bemærke, at mitokondrielt målrettet p53 for nylig har vist sig at have tumorundertrykkende aktiviteter også in vivo (Talos et al., 2005).
Dertil kommer, at caspase-2 har evnen til at aktivere den mitokondrielle apoptosevej som reaktion på DNA-skader ved at permeabilisere den ydre mitokondrielle membran og/eller ved at bryde cytochrom c’s tilknytning til den indre mitokondrielle membran. Derfor var celler, der var stabilt transficeret med procaspase-2 antisense, eller som transient udtrykte siRNA, refraktære over for frigivelse af cytokrom c og forskellige nedstrømsbegivenheder, såsom caspaseaktivering og DNA-fragmentering, induceret af DNA-skader (Lassus et al., 2002; Robertson et al., 2002). Caspase-2 kan virke indirekte på mitokondrierne, f.eks. ved at kløve det proapoptotiske protein Bid, efterfulgt af dets translokation til mitokondrierne for at inducere frigivelse af cytochrom c (Guo et al., 2002). Derudover kan caspase-2 direkte permeabilisere den ydre mitokondriemembran og stimulere frigivelsen af cytokrom c og Smac/DIABLO, muligvis som følge af direkte interaktion af behandlet caspase-2 med formodede proteiner og/eller fosfolipider, der befinder sig i den ydre mitokondriemembran eller på kontaktsteder mellem den ydre og indre membran (Robertson et al., 2004). Permeabilisering af den ydre mitokondriemembran kræver processering af caspase-2 zymogenet, men ikke den tilknyttede proteolytiske aktivitet og sker uafhængigt af flere proteiner fra Bcl-2-familien, herunder Bax, Bak og Bcl-2 (Robertson et al., 2004). Endvidere blev det også påvist, at caspase-2 har den overraskende evne til at afbryde forbindelsen mellem cytochrom c og anioniske fosfolipider, navnlig cardiolipin, hvorved yderligere cytochrom c bliver tilgængeligt til frigivelse i cytosolen (Enoksson et al., 2004). Ved DNA-skader er caspase-2 for nylig blevet rapporteret at blive aktiveret i det såkaldte PIDDosom, et kompleks af det p53-inducerbare, dødsdomæneholdige protein PIDD, caspase-2 og adaptorproteinet RAIDD (Tinel og Tschopp, 2004), hvilket peger på eksistensen af en nukleo-mitokondriel apoptotisk vej.
Det er desuden blevet rapporteret, at histon H1.2 spiller en vigtig rolle i overførslen af apoptotiske signaler fra kernen til mitokondrierne efter DNA-dobbeltstrengsbrud (Konishi et al, 2003). Histon H1.2 i kernen frigives til cytoplasmaet gennem en p53-afhængig mekanisme efter DNA-dobbeltstrengsbrud og inducerede frigivelse af cytochrom c fra isolerede mitokondrier på en Bak-afhængig måde (Konishi et al., 2003). Reduktion af H1.2-udtrykket øgede den cellulære modstandsdygtighed over for apoptose induceret af røntgenbestråling eller etoposid (Konishi et al., 2003).
Dertil kommer, at den forældreløse nukleare receptor Nur77 (også kendt som TR3) for nylig er blevet koblet sammen med Bcl-2 apoptosemaskineriet i mitokondrierne (Lin et al., 2004). Nur77-binding til Bcl-2’s N-terminale loop-region, der er placeret mellem BH4- og BH3-domænerne, inducerer en konformationsændring af Bcl-2, som blotlægger BH3-domænet, hvilket resulterer i en konvertering af Bcl-2 fra en beskytter til en dræber (Lin et al., 2004). Interessant nok er forhøjede niveauer af et Nur77-familiemedlem blevet forbundet med gunstige reaktioner på kemoterapeutiske midler hos patienter (Shipp et al., 2002).
Dertil kommer, at ved cellulær stress, herunder kemoterapeutiske lægemidler, aktiveres, derepresses eller induceres specifikke proapoptotiske Bcl-2-familiemedlemmer og fungerer derved som sensorer. Aktiviteten af BH3-only-proteiner holdes i skak af flere mekanismer, der holder disse proteiner væk fra de multidomænede Bcl-2-modstykker under normale omstændigheder, men som alligevel tillader deres hurtige aktivering under stressbetingelser (Bouillet og Strasser, 2002). Som nævnt ovenfor er proteiner fra Bcl-2-familien, såsom Bid, Puma og Noxa, under transkriptionskontrol af tumorsuppressoren p53 og opreguleres derfor som reaktion på DNA-skadelige stoffer (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). BH3-proteinet Bim, som er associeret med cytoskelettet ved at binde sig til mikrotubuli, frigøres og aktiverer den intrinsiske vej efter behandling med taxol, som virker på mikrotubuli-samlingen (Sunters et al., 2003). For nylig er det blevet påvist, at paclitaxel inducerer Bim-akkumulering og Bim-afhængig apoptose i epitheltumorer in vitro og også in vivo (Tan et al., 2005). Aktive BH3-proteiner binder og modvirker antiapoptotiske og i nogle tilfælde aktiverer multidomæner proapoptotiske Bcl-2-familiemedlemmer, hvilket fører til tab af mitokondriemembranpermeabilitet (Bouillet og Strasser, 2002). Hvordan Bcl-2-proteiner inducerer forstyrrelser i mitokondriernes ydre membran er stadig genstand for debat og kan involvere den poredannende og selvoligomeriserende kapacitet hos nogle Bcl-2-familieproteiner, modulering af den mitokondrielle permeabilitetsovergangspore ved hjælp af Bcl-2-familieproteiner og/eller lipidændringer og lipidproteininteraktioner inden for mitokondriemembranerne. Kemoterapeutiske midler som f.eks. paclitaxel forårsager desuden hyperfosforylering og inaktivering af Bcl-2 og fremmer samtidig åbningen af permeabilitetsovergangsporen (PT) (Ruvolo et al, 2001).
Kemoterapeutiske lægemidler kan også inducere eller lette permeabilisering af den ydre mitokondriemembran gennem ændringer i cellulære redoxpotentialer som følge af en øget generering af reaktive oxygenarter (eller et fald i deres afgiftning), udtømning af reduceret glutathion eller udtømning af NADPH, da den mitokondrielle megakanal har flere redoxfølsomme steder (Debatin et al., 2002). Desuden kan ændringer i energistofskiftet, f.eks. udtømning af ADP og ATP, lette åbningen af permeabilitetsovergangsporekomplekset (PTPC), da ADP og ATP er de fysiologiske ligander for adeninnukleotidtranslokatoren, der fungerer som endogene inhibitorer af PTPC (Costantini et al., 2000). Desuden kan afkobling eller hæmning af respirationskæden eller matrixalkalinisering begunstige mitokondriemembranpermeabilisering. Desuden kan lipid-budbringere såsom ceramid, som dannes i celler, der udsættes for flere apoptoseinducerende stimuli, herunder cytotoksiske lægemidler, bidrage til mitokondriemembranpermeabilisering (Susin et al., 1997). I høje koncentrationer kan nogle kemoterapeutiske lægemidler, f.eks. etoposid eller paclitaxel, også inducere permeabilisering af mitokondriernes ydre membraner i isolerede mitokondrier (Robertson et al., 2000; Kidd et al., 2002).
Dertil kommer, at et stigende antal eksperimentelle lægemidler mod kræft, herunder arsenit, lonidamid, det syntetiske retinoid CD437 eller naturproduktet betulinsyre, har vist sig at virke direkte på mitokondrier (Debatin et al., 2002). For eksempel er betulinsyre blevet rapporteret til at udløse apoptose ved direkte at inducere tab af mitokondriemembranpotentiale i isolerede mitokondrier på en måde, som ikke påvirkes af caspasehæmmeren Z-VAD-fmk og alligevel hæmmes af BA, en inhibitor af PTPC, eller af Bcl-2 og Bcl-XL (Fulda et al, 1998b).
Strategier rettet mod den intrinsiske vej
Bcl-2 familieproteiner
Da antiapoptotiske Bcl-2-proteiner, som potent blokerer den intrinsiske apoptosevej, findes i forhøjede niveauer i humane kræftformer af både hæmatologisk og ikke-hæmatologisk oprindelse (Cotter, 2004), udgør de lovende mål for terapeutiske interventioner. Der er derfor blevet udviklet flere strategier til at målrette Bcl-2-proteiner, f.eks. antisense-teknikker, BH3-domænepeptider eller syntetiske små molekylære lægemidler, der griber ind i Bcl-2-lignende proteiners funktion. For at nedregulere Bcl-2 ekspressionen blev Bcl-2 antisense oligonukleotidex (genasense) udviklet af Genta Incorporated (Berkeley Heights, NJ, USA). Genasense er et syntetisk, 18-base, enkeltstrenget fosforothioat-oligonukleotid, der selektivt er rettet mod de første seks kodoner (dvs. 18 baser) i den åbne læseramme af mRNA, der koder for Bcl-2-proteinet (Cotter, 2004). Behandling med genasense forbedrede markant antitumoraktiviteten af mange kemoterapeutiske lægemidler, f.eks. taxaner, anthracykliner, alkylatorer eller platinholdige midler (Cotter, 2004). I en præklinisk model af melanom øgede forbehandling med genasense kemosensitiviteten af humant melanom (Jansen et al., 1998). Også i et klinisk forsøg blev det rapporteret, at genasense fungerede som kemosensibiliserende middel for dacarbazin hos patienter med malignt melanom (Jansen et al., 2000). For at optimere antisense-baseret terapi blev der efterfølgende designet bispecifikke antisense-oligonukleotider rettet mod en sekvens, som er meget homolog i Bcl-2 og Bcl-xL, men som mangler i Bcl-xS mRNA (Zangemeister-Wittke et al., 2000). Samtidig nedregulering af både Bcl-2 og Bcl-xL inducerede apoptose og øget kemosensitivitet i forskellige kræftceller (Gautschi et al., 2001; Tortora et al., 2003; Milella et al., 2004; Yamanaka et al., 2005).
Der blev endvidere udviklet BH3-domænepeptider eller syntetiske små molekylære inhibitorer til at målrette antiapoptotiske Bcl-2-lignende proteiner. BH3-domænet består af en amfipatisk α-helix med ni aminosyrer, der binder sig til en hydrofob lomme i Bcl-2-lignende proteiner (Cory og Adams, 2002). Tilsvarende har BH3-domænepeptider til formål at afbryde dette kompleks og derved gøre kræftceller følsomme over for apoptosi (Letai et al., 2002). Desuden resulterede substitution af Bid BH3-domænet med ikke-naturlige aminosyrer på overfladen modsat den interagerende region ved hjælp af kulbrintehæftning i stabiliserede BH3-peptider kaldet SAHB’er (stabiliseret α-helix af Bcl-2-domæner), med forbedrede farmakologiske egenskaber (Walensky et al., 2004). Disse stabiliserede BH3-peptider udløste apoptose i en række leukæmiske cellelinjer og hæmmede også væksten af leukæmi xenografts i mus uden negative bivirkninger (Walensky et al., 2004).
Der er også blevet identificeret flere små molekylforbindelser, der interfererer med Bcl-2/Bcl-xL-funktionen. Screening af et kemisk bibliotek for forbindelser, der er i stand til at binde til BH3-lommen i Bcl-2-proteinerne, resulterede i identifikation af HA14-1, en forbindelse, der konkurrerer med Bak om bindingen til Bcl-2 (Wang et al., 2000). Ved at screene et bibliotek af 16 320 forhåndsudvalgte forbindelser for evnen til at fortrænge et fluorescerende Bak BH3-peptid fra Bcl-xL i et fluorescerende polarisationsassay identificerede Degterev et al. (2003) to klasser af stoffer kaldet BH3-inhibitorer (BH3Is), som også forstyrrer Bcl-xL-komplekset med Bax og Bad i intakte celler.
Gennem kernemagnetisk resonans (NMR)-baseret screening, parallel syntese og strukturbaseret design blev der for nylig opdaget en småmolekylær inhibitor af de antiapoptotiske proteiner Bcl-2, Bcl-X(L) og Bcl-w, ABT-737, som er en lillemolekylær inhibitor af de antiapoptotiske proteiner Bcl-2, Bcl-X(L) og Bcl-w. ABT-737 var effektiv som enkeltstof mod visse lymfomer og solide tumorer og udviste synergistisk cytotoksicitet med kemoterapeutika og stråling (Oltersdorf et al., 2005).
Smac/DIABLO-agonister
Med hensyn til design af potentielt terapeutiske små molekyler til målretning af XIAP har bindingsrillen i XIAP’s BIR3-domæne, som Smac/DIABLO binder sig til efter frigivelse fra mitokondrier, tiltrukket sig mest opmærksomhed. Strukturel analyse har givet et klart rationale for syntese af små forbindelser, der kan efterligne Smac/DIABLO’s caspase-9 fortrængningsaktivitet af Smac/DIABLO fra XIAP BIR3 (Chai et al., 2000; Wu et al., 2000). For at forbedre intracellulær levering blev Smac-peptider knyttet til en bærer, f.eks. proteintransduktionsmotivet i HIV Tat-proteinet (Fulda et al., 2002), Drosophila antennapaedia penetratin-sekvensen (Arnt et al., 2002) eller en polyarginin-strækning (Yang et al., 2003b). Et heptapeptid, der repræsenterer N-terminus af moden Smac/DIABLO, som er afgørende for binding til XIAP, blev rapporteret til at fremme caspaseaktivering og til at sensibilisere forskellige tumorcellelinjer og også primære patienters afledte tumorceller for apoptose induceret af dødsreceptorligering eller cytotoksiske lægemidler (Fulda et al., 2002). Det er vigtigt at bemærke, at Smac-peptider endog forstærkede TRAIL’s antitumoraktivitet in vivo i en intrakraniel malignt gliom xenograftmodel (Fulda et al., 2002b). Ligeledes var et 8-mer peptid (AVPIAQKS), der var fusioneret med proteintransduktionsdomænet af Drosophila antennapaedia penetratin, i stand til at trænge ind i brystkræftceller, binde XIAP og cIAP1 og potensere caspaseaktivitet induceret af en række kræftmedicin, herunder paclitaxel, etoposid, 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin (SN-38) og doxorubicin (Arnt et al., 2002). Desuden blev der på grundlag af den tredimensionelle struktur af Smac/DIABLO i kompleks med XIAP BIR3 designet Smac-peptidomimetika, som samarbejdede med TRAIL, TNFα, cisplatin eller etoposid for at udløse apoptose i tumorceller (Li et al., 2004; Sun et al., 2004a, 2004b, 2005).
Derpå blev der udviklet ikke-peptidiske små molekylære antagonister af XIAP, som blev afledt ved screening af et phagebibliotek eller et polyphenylurea-bibliotek, til målretning af IAP’er (Schimmer et al., 2004; Wang et al., 2004). Desuden blev naturproduktet embelin fra den japanske Ardisia-urt for nylig opdaget som en cellepermeabel, ikke-peptidisk, småmolekylær inhibitor af XIAP gennem strukturbaseret beregningsmæssig screening af en traditionel urtemedicinsk tredimensionel strukturdatabase (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Embelin viste sig effektivt at overvinde den beskyttende virkning af XIAP i prostatakræftceller med høje endogene niveauer af XIAP eller i Jurkat-celler transficeret med XIAP ved at binde til XIAP BIR3-domænet (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Således kan Smac-agonister eller XIAP-antagonister med lav molekylvægt være lovende kandidater til kræftbehandling ved at potentiere effektiviteten af cytotoksiske terapier selektivt i kræftceller.