Fluorescerende proteiner fra A. victoria
Spektrale egenskaber af GFP eller dens varianter ligger i den aminosyrestruktur, der danner chromoforen (Figur 1). Det kan være de tre aminosyrer på positionerne 65-67 eller rester tæt på dette sted (f.eks. YFP). Ud over de vigtigste mutationer vedrørende kromoforen blev der også forsket i andre stedbestemte mutationer for at forbedre andre faktorer som f.eks. proteinmodning og ekspression i heterologe cellesystemer (f.eks. kodonanvendelse, proteinfoldning ved fysiologisk temperatur). Bemærk, at A. victoria er en relativt primitiv havorganisme uden kropsvarmesystem.
Selv om GFP er en af de mest populære FP’er på grund af dens lysstyrke og høje fotostabilitet, har den to store ulemper. Disse er en vis følsomhed over for pH og en svag tendens til at dimerisere. Dimerisering eller oligomerisering er et problem for mange FP’er. Deres præference for at agglutinere med hinanden kan give artefakter eller fejlfortolkninger vedrørende det fusionerede proteins placering og funktion. Men forskerne har også fundet nogle løsninger på dette problem. Mutationer på kritiske positioner (F223R, L221K og A206K), hvor upolære aminosyrer erstattes af hydrofile aminosyrer, viser en reduceret dimerisering. Alle de genetiske ændringer, der fører til en forbedring af såvel spektrale som praktiske egenskaber, er sammenfattet under betegnelsen “forbedrede” FP’er.
For wtGFP’s vedkommende fører forbedringerne til en EGFP (enhanced GFP) med et enkelt excitationstop ved 488 nm i stedet for det tidligere komplekse absorptionsspektrum ved 395 nm og 475 nm. Den første muterede version af wtGFP (S65T-mutanten) udviklet af Roger Tsien et al. var fem gange så lysstærk som den oprindelige og viste en kortere modningstid. Sammen med en bedre modningseffektivitet ved 37 °C, baseret på en anden mutation (F64L), spiller dette en vigtig rolle for folk, der ser på levende celler.
En meget interessant GFP-variant med et af de største Stokes-skift er Sapphire. En mutation på en position tæt på kromoforen (T203I) fører til en ændring af excitationsmaksimum til 399 nm og emissionsmaksimum til 511 nm. Dette er et Stokes-skift på 112 nm. Emerald er en anden GFP-modifikation med forbedret fotostabilitet og lysstyrke og mere effektiv foldning i pattedyrceller.
Mens alle de grøn fluorescerende proteiner har en relativt høj lysstyrke, lider blå fluorescerende proteiner normalt under nedsat emissionsintensitet i mikroskopiske anvendelser. Ikke desto mindre anvendes de i optiske analyser på grund af andre spektrale egenskaber. EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein) blev konstrueret ved flere omgange at mutere wtGFP. Den første (Y66H) sprang emissionstoppen fra det grønne til det blå spektrum over. Derefter fulgte flere mutationer, hvorved der blev fremstillet et protein med et excitationsmaksimum ved 380 nm og et emissionsmaksimum ved 448 nm. Disse spektrale egenskaber gør det til en partner for EGFP i FRET-mikroskopi. Nyere blå fluorescerende proteiner med højere kvanteudbytte og bedre fotostabilitet er Azurite, SBFP2 og EBFP2. En lovende EBFP-efterfølger er et protein ved navn Sirius, som blev populært på grund af dets meget høje tolerance over for pH (stabilt fra pH 3-9) og dets ry for at være det fluorescerende protein med den korteste emissionsbølgelængde til dato.
En anden “blå” klasse af GFP-varianter udgøres af cyanfluorescerende proteiner: CFP’er. Udskiftning af tyrosin med tryptofan (Y66W) og yderligere genetiske ændringer fører til et fluorochrom med forbedret lysstyrke og fotostabilitet. Dette ECFP har et bimodalt excitations- og emissionsspektrum ved 433/445 nm og 475/503 nm. Lysstyrken er kun ca. 40 % af EGFP’s lysstyrke. En fremtrædende ECFP-variant er Cerulean, som har en højere ekstinktionskoefficient og et højere kvanteudbytte. Den er 1,5 gange lysere end ECFP og anvendes som FRET-partner med YFP.
En GFP-mutation, der ikke direkte ændrer en af de tre centrale aminosyrer i kromoforen, resulterede i fremkomsten af gule fluorescerende proteiner. YFP’er har en fælles threonin i position 203, som er udskiftet med en tyrosin (T203Y). Denne aminosyre er en del af β-tønden og ligger i umiddelbar nærhed af kromoforen. Sammenlignet med GFP er excitations- og emissionsegenskaberne blevet forskudt til længere bølgelængder med excitations- og emissionsmaksima ved 514 nm og 527 nm (EYFP). Et kendetegn ved EYFP er dens pH-følsomhed. Ved pH 6,5 har EYFP kun ca. 50 % af sin fluorescens, hvilket ikke altid er en ulempe. Når det drejer sig om pH-måling (f.eks. af vesikler, endosomer osv.), kan EYFP anvendes som indikator. Interessant nok udviklede en yderligere mutation (Q69M) en bedre syrestabilitet og en dramatisk forbedret lysstyrke (75 % lysere end EGFP). Dette protein, som stadig har en dårlig fotostabilitet sammenlignet med EGFP, blev kaldt Citrine. En anden YFP-mutant (F46L) viste en drastisk hurtigere modningshastighed og også en forbedret pH-resistens. Dette protein blev kaldt Venus og er en hyppig FRET-acceptor sammen med Cerulean.