Braz J Med Biol Res, oktober 2003, Volume 36(10) 1447-1454
Genet for 5-alfa-reduktase type 1, men ikke type 2, udtrykkes i anagenshår, der er plukket fra vertex-området af hovedbunden hos hårde kvinder og normale personer
I.O. Oliveira1,2, C. Lhullier1, I.S. Brum1 og P.M. Spritzer1,3
1Departamento de Fisiologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil
2Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil
3Unidade de Endocrinologia Ginecológica, Serviço de Endocrinologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brasil
Resumé
Resumé 
Sigtet med denne undersøgelse var at bestemme ekspressionen af generne for type 1 (SDR5A1) og type 2 (SDR5A2) 5a-reduktase isoenzymer i hovedbundshår plukket fra 33 hirsutistiske patienter (20 med polycystisk ovariesyndrom og 13 med idiopatisk hirsutisme) og sammenligne det med 10 mænd og 15 normale kvinder. SDR5A1- og SDR5A2-ekspressionen blev vurderet ved RT-PCR ved hjælp af genet for det ubiquitært udtrykte protein ß2-mikroglobulin som en intern kontrol. Resultaterne er udtrykt som arbitrære enheder i forhold til ß2-mikroglobulinabsorbansen (gennemsnit ± SEM). SDR5A2-ekspression blev ikke påvist i nogen af de hårprøver, der blev analyseret i denne undersøgelse. Der blev ikke fundet nogen forskelle i SDR5A1 mRNA-niveauerne mellem mænd og normale kvinder (henholdsvis 0,78 ± 0,05 vs. 0,74 ± 0,06). SDR5A1-genekspressionen i cellerne i hår plukket fra hovedbunden hos normale kvinder (0,85 ± 0,04) og hos kvinder med polycystisk ovariesyndrom (0,78 ± 0,05) og idiopatisk hirsutisme (0,80 ± 0,06) var også ens. Disse resultater tyder på, at SDR5A1-genekspressionen i de follikulære keratinocytter fra hovedbundens vertexområde ikke synes at være relateret til de forskelle i hårvækst, der er observeret mellem normale mænd og kvinder og hirsutte patienter. Der er behov for yderligere undersøgelser for at undersøge ekspressionen af 5a-reduktase generne i andre follikelkompartmenter i hovedbunden, såsom dermal papillae, og også i hårfollikler fra andre steder på kroppen, for at belyse mekanismen for androgens virkning på hårvækstprocessen og relaterede sygdomme.
Nøgleord: Hårfollikel, Hirsutisme, 5a-Reduktase, Polycystisk ovariesyndrom
Introduktion
Androgener er de vigtigste regulatorer af den menneskelige hårvækst og er forbundet med en af de vigtigste kliniske hårvækstforstyrrelser, nemlig hirsutisme. Denne tilstand svarer til overdreven vækst af kropsbehåring hos kvinder med et mandligt mønster i fordelingen af kropsbehåring. Tilstedeværelsen af hirsutisme kan signalere tilstande, der er forbundet med øget androgenudskillelse fra æggestokkene og/eller binyrerne, såsom polycystisk ovariesyndrom (PCOS), androgenudskillende tumorer og ikke-klassisk binyrebarkhypoplasi, eller kan skyldes perifer overfølsomhed over for cirkulerende androgener (idiopatisk hirsutisme, IH) (1-3). Selv om denne tilstand generelt ikke er livstruende, er den meget belastende for patienterne og har en betydelig negativ psykosocial indvirkning. Undersøgelse af androgenernes virkninger på hårvækst i forbindelse med hirsutisme bør forbedre vores viden om den menneskelige hårfollikelbiologi.
Effekten af alle aktive androgener på målceller formidles ved deres binding til den samme nukleare androgenreceptor. Tidligere undersøgelser af androgenresistenssyndromer har afsløret betydningen af androgenreceptoren for androgenafhængig hårvækst (4-6). For nylig blev der observeret en øget androgenbindingskapacitet i hårceller i hovedbunden hos skaldede mænd (7). Der er dog hidtil ikke fundet nogen konsekvent forskel i antallet eller funktionen af androgenreceptoren hos hirsute patienter sammenlignet med normale personer (8,9).
Hårfollikler har autonom kontrol over androgenmetabolismen, idet de justerer produktionen og nedbrydningen af steroidhormoner i overensstemmelse med lokale krav (10). Under normale forhold har 5a-reduktase en nøglerolle i androgenernes virkning på hårsækkene, idet det omdanner testosteron til det mere potente androgen dihydrotestosteron (11,12). Undersøgelser af molekylær kloning har karakteriseret to gener, der koder for type 1- og type 2-isoenzymerne 5a-reduktase (13,14). Det 5a-reduktase-isoenzym, der er fremherskende i huden, er type 1 (SDR5A1) (15), som har 60 % homologi med 5a-reduktase type 2 (SDR5A2), der er karakteristisk for prostatakirtlen (14). Der er påvist en forøgelse af 5a-reduktaseaktiviteten i fibroblaster i genital- og skamhuden fra hirsute patienter i sammenligning med huden hos normale kvinder (8,16). Disse undersøgelser har rapporteret en stigning i 5a-reduktaseaktivitet selv hos IH, som er karakteriseret ved fravær af forhøjede plasma-androgenniveauer (17). Desuden udtrykker skamhuden hos hirsute patienter den samme SDR5A1-isoform som skamhuden hos normale personer, mens SDR5A2 hovedsageligt udtrykkes i kønshud fra både normale personer og hirsute patienter (18). Den fysiologiske rolle, som 5a-reduktase-isoenzymerne spiller, er imidlertid ikke helt klarlagt, og deres fordeling i forskellige hudområder er stadig uklar. Nogle immunhistokemiske og enzymaktivitetsundersøgelser har antydet en fremherskende ekspression af SDR5A1-enzymet i talgkirtler, men også i svedkirtler, epidermalceller, rodskeder og dermale papilceller fra hårfollikler (19-21), mens SDR5A2 kun udtrykkes i disse kompartmenter i meget lave niveauer. I modsætning hertil har andre undersøgelser vist en anden fordeling af disse isoenzymer i pilosebaceous-enheden (22-24). Der synes at være en større fordeling af SDR5A1 i hårfollikelkompartmenter sammenlignet med SDR5A2. Da rodskede keratinocytter desuden viser høj ekspression af SDR5A1-genet, spiller de sandsynligvis en vigtig rolle i androgenmetabolismen i hårfolliklerne.
Formålet med denne undersøgelse var at vurdere ekspressionen af SDR5A1- og SDR5A2-generne i hårrodskede celler i hårrodskedecellerne i vertex-området af hovedbunden fra hirsute patienter og sammenligne det med normale personer af begge køn.
Patienter og metoder
Subjekter
Undersøgelsespopulationen omfattede kvinder, der konsulterede for hirsutisme, og som blev set konsekutivt i løbet af en 6-måneders periode på den gynækologiske endokrinologiske afdeling på Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brasilien. Treogtredive patienter i alderen fra 12 til 42 år blev udvalgt til undersøgelsen. Tyve patienter blev diagnosticeret som havende PCOS og 13 som havende IH. Diagnosen PCOS var baseret på fysiske kendetegn som hyperandrogenisme, forstyrret menstruationscyklus, forhøjet niveau af luteiniserende hormon (LH) i serum eller LH/follikelstimulerende hormon-forholdet, forhøjet niveau af total testosteron og/eller frit androgen-indeks (FAI), ultralydsbeviser for bilaterale forstørrede polycystiske æggestokke (25,26) og fravær af ovarie- eller binyreknuder eller Cushing-syndrom. IH blev diagnosticeret som tidligere beskrevet (27) hos hirsute patienter med regelmæssige ægløsningscyklusser (progesteronniveauer i lutealfasen højere end 3,8 ng/ml), normale androgenniveauer og uden nogen kendt underliggende sygdom.
Patienter med sent indstillet (ikke-klassisk) medfødt binyrebarkhypoplasi blev ikke taget i betragtning til undersøgelsen på grund af et højt plasmaniveau af 17-hydroxyprogesteron (>5 ng/ml) og/eller dets markante stigning efter ACTH-stimulering (>12 ng/ml) (28,29). Patienter med hyperprolaktinæmi (serumprolaktinniveauer højere end 20 µg/l ved to forskellige lejligheder) blev også udelukket.
Femten normale kvinder med regelmæssige menstruationscyklusser i alderen 16-37 år og ti mænd i alderen 16-29 år blev også udvalgt til undersøgelsen, som blev godkendt af den etiske komité på Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Der blev indhentet informeret samtykke fra hver enkelt forsøgsperson. Ingen af forsøgspersonerne havde modtaget nogen lægemidler, der var kendt for at forstyrre androgen-, østrogen- eller gonadotropin-serumniveauerne i mindst 3 måneder før undersøgelsen.
SDR5A1- og SDR5A2-mRNA-niveauerne blev estimeret ved omvendt transkription-polymerase-kædereaktion (RT-PCR) i hårceller plukket fra vertex-delen af hovedbunden hos normale mænd, normale kvinder og hirsutte patienter.
Undersøgelsesprotokol
Antropometriske målinger omfattede kropsvægt, højde og kropsmasseindeks (BMI = aktuel målt vægt i kg divideret med højde i m2). Hirsutismescore blev gradueret efter Ferriman-Gallwey-metoden (30), eksklusive områderne underben og underarme.
Hormonel vurdering blev udført mellem dag 2 og 10 i menstruationscyklus eller på en hvilken som helst dag, hvor patienterne var amenorroiske. Efter en faste natten over blev der udtaget blodprøver fra en antecubital vene til bestemmelse af LH, kønshormonbindende globulin (SHBG) og samlet testosteron. Alle prøver blev udtaget mellem kl. 8 og 10 om morgenen. FAI blev estimeret ved at dividere total testosteron (nmol/l) med SHBG (nmol/l) x 100.
Assays
Total testosteron blev målt ved hjælp af dobbelt-antistof radioimmunoassay (ICN, Costa Mesa, CA, USA) med en assay detektionsgrænse på 0.04 ng/ml og en intra- og interassay-varianskoefficient (CV) på henholdsvis 10 og 15 %; SHBG blev målt ved et immunokemiluminometrisk assay (ICMA; DPC, Los Angeles, CA, USA) med en detektionsgrænse på 0,2 nmol/l og en intra- og interassay-CV på henholdsvis 5,0 og 8,0 %. LH blev målt ved hjælp af ICMA med en detektionsgrænse på 0,7 mIU/ml og et intra- og interassay CV på henholdsvis 5,2 og 8,0 %.
RT-PCR-protokol
Plukkede anagenhår blev indsamlet fra vertex af hovedbunden hos alle forsøgspersoner og blev straks frosset ned i flydende nitrogen og transporteret til laboratoriet til assays. Udvinding af total RNA og syntese af cDNA blev udført som tidligere beskrevet (31). De plukkede hårrødder blev homogeniseret i phenol-guanidin-isothiocyanat (Trizol, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA). Samlet RNA blev ekstraheret med chloroform og udfældet med isopropanol ved 12.000 g centrifugering ved 4ºC. RNA-pelletet blev vasket to gange med 75 % ethanol, resuspenderet i diethylpyrocarbonatbehandlet vand og kvantificeret ved absorbans ved 260 nm.
Første streng cDNA blev syntetiseret fra 5 µg total RNA til alle reaktioner ved hjælp af SuperScript Preamplification System (Gibco-BRL). Efter denaturering af skabelon-RNA og primere ved 70ºC i 10 min. blev omvendt transkriptase tilsat i tilstedeværelse af 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, plus 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM dNTP-blanding og 10 mM dithiothreitol, og inkuberet ved 42ºC i 55 min. Blandingen blev opvarmet til 70ºC for at stoppe reaktionen og derefter inkuberet med E. coli RNase i 20 min. ved 37ºC for at ødelægge utransskriberet RNA. Den skabelon (cDNA), der blev anvendt i de forskellige PCR-analyser, blev fremstillet fra den samme omvendte transkriptionsreaktion. PCR blev udført i et slutvolumen på 50 µl. To mikroliter af første strengsyntesereaktionen (med et forventet cDNA-udbytte på 10 ng) blev denatureret ved 94 ºC i 3 min (kun 2 min for ß2-mikroglobulin) i tilstedeværelse af 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, plus 50 mM KCl og 1,5 mM MgCl2. Efter denne varmstart blev der tilsat 1,25 U Taq DNA-polymerase sammen med den samme Tris-HCl-buffer, 1,5 mM MgCl2, 0,4 µM sense- og antisense-primere og 0,2 mM dNTP-blanding.
Et 368-bp-fragment af SDR5A1 (24) og et 566-bp-fragment af SDR5A2 (14) cDNA-sekvensen blev amplificeret ved hjælp af primere, der var designet til at spænde over intron-exon-grænserne for at forhindre amplifikation af kontaminerende genomisk DNA. Et 623-bp cDNA-fragment svarende til det ubiquitært udtrykte protein ß2-mikroglobulin (32) blev amplificeret for at normalisere cDNA-mængderne i hver prøve. cDNA-sekvenserne af SDR5A1- og SDR5A2- og ß2-mikroglobulin-primere er anført i tabel 1. PCR blev standardiseret ved at afprøve et antal cyklusser (20 til 45), og amplifikationen blev udført i det lineære område. De endelige PCR-betingelser var som følger: 35 cyklusser (45 s ved 94ºC, 45 s ved 60ºC, 90 s ved 72ºC, 10 min ved 72ºC) for SDR5A1, 40 cyklusser (1 min ved 94ºC, 1 min ved 65ºC, 2 min ved 72ºC, 5 min ved 72ºC) for SDR5A2, og 30 cyklusser (1 min ved 94ºC, 1 min ved 55ºC, 1 min ved 72ºC, 5 min ved 72ºC) for ß2-mikroglobulin. cDNA fra dissocierede celler fra humane prostatakirtler blev anvendt som positiv kontrol for alle PCR-reaktioner. Der blev ikke tilsat cDNA til de negative reaktioner. En prøve af PCR-blandingen (15 µl) blev størrelsesfraktioneret på 1,5-2,0 % agarosegel farvet med ethidiumbromid, kørt ved 100 V og visualiseret under UV-lys. De forventede bånd blev kvantificeret ved densitometrisk analyse ved hjælp af et billedbehandlingssystem (ImageMaster VDS, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige).
Statistisk analyse
Data er rapporteret som gennemsnit ± SEM, medmindre andet er angivet. Gruppernes gennemsnit blev sammenlignet ved Student t-test eller ved envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Duncan-test, og medianværdier blev sammenlignet ved Mann-Whitney-test. Forskelle blev anset for at være statistisk signifikante ved P < 0,05. Alle analyser blev udført ved hjælp af Statistical Packages for the Social Sciences (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).
Resultater
Tabel 2 opsummerer de antropometriske og hormonelle data for patienter med PCOS og IH. Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle mellem de to grupper af hirsutistiske patienter med hensyn til alder eller klinisk score for hirsutisme. Hirsute patienter med PCOS havde imidlertid et højere BMI og viste signifikant højere niveauer af testosteron, FAI og LH end IH-gruppen. SHBG-koncentrationerne var lavere i PCOS-gruppen end i IH-gruppen.
SDR5A2-genekspression blev ikke påvist i nogen hårbundshårprøver, der blev analyseret ved RT-PCR i den foreliggende undersøgelse (figur 1).
Figur 2 viser SDR5A1 mRNA-niveauer i hårceller plukket fra hovedbunden hos normale forsøgspersoner. SDR5A1-ekspression, præsenteret som arbitrære enheder i forhold til ß2-mikroglobulinabsorbans, var ens hos mænd (0,78 ± 0,05) og normale kvinder (0,74 ± 0,06). Desuden blev der ikke observeret nogen signifikante forskelle i follikulær keratinocyt SDR5A1-ekspression mellem normale kvinder (0,85 ± 0,04) og PCOS (0,78 ± 0,04) eller IH (0,80 ± 0,06) hirsute grupper (Figur 3).
|
|
Figur 1. Repræsentativ agarosegel farvet med ethidiumbromid, der viser ingen ekspression af SDR5A2 mRNA ved RT-PCR i hårceller plukket fra hovedbunden hos mænd (1 til 9), normale kvinder (10 til 17) og hirsute patienter: PCOS-gruppen (18 til 31) og IH-gruppen (32 til 39). Fragmentet på 566 bp svarer til SDR5A2 (5a-R2) og fragmentet på 623 bp svarer til ß2-mikroglobulin (ß2-m). SDR5A2-amplificering blev kun visualiseret i dissocierede prostataceller, der blev anvendt som positiv kontrol (+). |
|
|
Figur 2. Repræsentativ gel, der viser SDR5A1 mRNA-niveauer bestemt ved RT-PCR i hårceller plukket fra hovedbunden hos mænd (1 til 7) og normale kvinder (8 til 14). Fragmentet på 368 bp svarer til SDR5A1 (5a-R1), og fragmentet på 623 bp svarer til ß2-mikroglobulin (ß2-m). RT-PCR-produkterne blev visualiseret på agarosegel farvet med ethidiumbromid. + = positiv kontrol. |
|
|
Figur 3. Repræsentativ gel, der viser SDR5A1 mRNA-niveauer bestemt ved RT-PCR i hårceller plukket fra hovedbunden hos normale kvinder (1 til 14) og hos begge grupper af hirsute patienter (PCOS: 15 til 26; IH: 27 til 35). Fragmentet på 368 bp svarer til SDR5A1 (5a-R1), og fragmentet på 623 bp svarer til ß2-mikroglobulin (ß2-m). RT-PCR-produkterne blev visualiseret på agarosegel farvet med ethidiumbromid. |
Diskussion
Og selv om 5a-reduktaseaktivitet i huden er forbundet med hirsutisme, skal den specifikke rolle og identifikationen af det isoenzym, der er involveret i denne kliniske hårvæksttilstand, stadig defineres bedre. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi mRNA-ekspression af begge typer 5a-reduktase i plukkede anagen hårceller i hovedbunden hos hirsute patienter.
Genet SDR5A1 blev udtrykt i plukkede hårceller, der blev opnået fra vertex af hovedbunden hos normale personer. Andre undersøgelser har vist lignende resultater, selv når SDR5A1 mRNA blev undersøgt i dyrkede follikulære keratinocytter (24,33). Plukkede anagenhår består hovedsageligt af keratinocytceller, der danner både ydre og indre rodskeder. Bindevævsskeden, den nederste pære, de dermale papilaceller og talgkirtlen er fraværende i de plukkede hår. Derfor bekræfter vores data genekspressionen af SDR5A1 i follikulære keratinocytter og er i overensstemmelse med andre, som viste 5a-reduktase immunoreaktivitet i rodskedeceller i hårfollikler (20,23).
I den foreliggende undersøgelse var SDR5A1 mRNA-niveauerne fra plukkede hovedbundshår ikke forskellige mellem normale mænd og kvinder. Tidligere undersøgelser har også beskrevet en lignende 5a-reduktaseaktivitet i hårfollikler fra mænd og kvinder (12,34). Derimod blev der påvist en højere 5a-reduktaseaktivitet i skamhudsprøver hos normale mænd end hos normale kvinder (1). Samlet set tyder disse resultater på, at 5a-reduktase-reguleringen hos normale personer synes at være forskellig mellem follikulære keratinocytter i hovedbunden og fibroblaster i skamhuden.
Hårfollikelceller i hovedbunden synes ikke at være hovedmålet for hirsutisme. Der er imidlertid nogle etiske vanskeligheder ved at få prøver fra ansigtet af hirsute patienter. Desuden findes der kun få litteraturrapporter om de molekylære mekanismer i hovedbundens hårfollikelceller i forbindelse med hirsutisme (9). Hovedbunden er et velkendt androgenfølsomt område hos begge køn, og det er relativt let at få en prøve af hovedbundshår. Derfor er det interessant at undersøge nogle aspekter af androgenmetabolismen i plukkede hårceller fra hovedbunden, især når det er muligt at sammenligne personer med en endogen eksponering for højere (PCOS) eller normale (IH) cirkulerende androgenniveauer.
Vi observerede ingen forskelle i SDR5A1 mRNA-niveauer i de follikulære keratinocytter, hverken mellem hirsutte patienter og normale kvinder eller mellem normale mænd og kvinder. Desuden viste patienter med høje serum-androgenniveauer (PCOS-gruppen) den samme SDR5A1-genekspression som patienter med IH og normale androgenniveauer. Selv om SDR5A1 er det isoenzym, der dominerer i huden (14), tyder de foreliggende resultater på, at cirkulerende androgener sandsynligvis ikke bidrager til SDR5A1-genekspressionen i hovedbundens follikulære keratinocytter, hvilket tyder på, at SDR5A1 ikke er det vigtigste isoenzym i den lokale androgenmetabolisme i hovedbundens hud. På den anden side er det påvist, at 5a-reduktasehæmmeren finasterid er effektiv i behandlingen af mandligt mønsterhårtab (35) samt i IH (36,37). Finasterid er en oralt aktiv inhibitor, der fortrinsvis blokerer 5a-reduktase type 2, men som også kan hæmme type 1-isoenzymet, hvilket medfører et markant fald i dihydrotestosteron- og 3a-androstenediolglucuronidniveauerne. Det har hverken affinitet for androgenreceptoren eller androgene, østrogene, progestationelle eller andre steroidale virkninger (38). I overensstemmelse med vores resultater indikerede disse undersøgelser, at 5a-reduktase type 2 sandsynligvis har en mere kritisk rolle i hårvækstprocessen og relaterede kliniske tilstande.
De foreliggende resultater viser, at SDR5A2-genet ikke blev udtrykt i de follikulære keratinocytter fra nogen forsøgspersoner, mænd eller normale kvinder eller hirsute patienter. Tidligere undersøgelser har beskrevet den præferentielle lokalisering af SDR5A2 mRNA og enzymaktivitet (39,40) i dermal papilaceller, selv om SDR5A2 immunoreaktivitet også blev fundet i keratinocytter i hårfollikel (20,22). De tilsyneladende uoverensstemmelser i proteinekspressionen mellem disse undersøgelser kan i det mindste delvist forklares ved de forskellige metoder til immunohistokemisk analyse af kvalitative data. Med hensyn til fraværet af SDR5A2-genekspression, der er beskrevet i nærværende undersøgelse, vil mere følsomme metoder til genekspressionsanalyse, f.eks. realtids-PCR, muligvis afklare dette spørgsmål i fremtiden.
Vi har ikke undersøgt genekspressionen af 5a-reduktase-isoenzymer i andre follikulære kompartmenter som dermale papiller, fordi disse celler ikke er til stede i plukkede isolerede hårstrå. Dermal papilacellerne fås kun ved excisionsbiopsi, hvilket er en invasiv og belastende metode. Det vil imidlertid være meget interessant at undersøge 5a-reduktase-isoenzymer i dermale papilaceller fra hirsute patienter, da det er blevet foreslået, at disse celler kan være det direkte mål for androgener i hårfollikler og regulere aktiviteten af hårmatrixen, melanocytter og keratinocytter med parakrine signaler (10).
SDR5A1 genekspression i de follikulære keratinocytter fra vertexområdet i hovedbunden synes ikke at være relateret til forskelle i hårvækst observeret mellem normale mænd og kvinder og hirsute patienter. Flere undersøgelser af reguleringen af 5a-reduktase-genekspressionen i hårfollikelceller på forskellige steder i kroppen kan bidrage til at belyse den intrigerende mekanisme for androgens virkning på hårvækstprocessen og tilknyttede sygdomme.
1. Kuttenn F, Mowszowicz I, Schaison G & Mauvais-Jarvis P (1977). Androgenproduktion og hudmetabolisme ved hirsutisme. Journal of Endocrinology, 75: 83-91.
2. New MI, Lorenzen F, Lerner AJ et al. (1983). Genotyping af steroid 21 hydroxylasemangel: hormonelle referencedata. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 57: 320-326.
3. Azziz R, Carmina E & Sawaya ME (2000). Idiopatisk hirsutisme. Endocrine Reviews, 21: 347-362.
4. Mauvais-Jarvis P, Bercovici JP & Gauthier F (1969). In vivo undersøgelser af testosteronmetabolismen i huden hos normale mænd og patienter med syndromet testikelfeminisering. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 29: 417-421.
5. Griffin JE & Wilson JD (1977). Undersøgelser om patogenese af de ufuldstændige former for androgenresistens hos mennesket. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 45: 1137-1143.
6. Kuttenn F, Mowszowicz I, Wright F, Baudot N, Jaffiol C, Robin M & Mauvais-Jarvis P (1979). Mandlig pseudohermafroditisme: en sammenlignende undersøgelse af et tilfælde af 5a-reduktasemangel med tre komplette former for testikelfeminisering. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 49: 861-865.
7. Hibberts NA, Howell AE & Randall VA (1998). Balding hårfollikel dermal papillaceller indeholder højere niveauer af androgenreceptorer end dem fra ikke-balding hovedbund. Journal of Endocrinology, 156: 59-65.
8. Mowszowicz I, Melanitou E, Doukani A, Wright F, Kuttenn F & Mauvais-Jarvis P (1983). Androgenbindingskapacitet og 5-reduktaseaktivitet i skamhudfibroblaster fra hirsute patienter. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 56: 1209-1213.
9. Oliveira IO, Lhullier C, Brum IS & & Spritzer PM (2003). Genekspression af type 2 17ß-hydroxysteroiddehydrogenase i hovedbundshår hos hirsute kvinder. Steroider (under tryk).
10. Randall VA (1994). Androgener og menneskelig hårvækst. Clinical Endocrinology, 40: 439-457.
11. Hay JB & Hodgins MB (1973). Metabolisme af androgener in vitro af menneskelig ansigts- og aksilhud. Journal of Endocrinology, 59: 475-486.
12. Takayasu S, Wakimoto H, Itami S & Sano S (1980). Aktivitet af testosteron 5a-reduktase i forskellige væv af menneskelig hud. Journal of Investigative Dermatology, 74: 187-191.
13. Andersson S, Bischop RW & Russell DW (1989). Ekspression, kloning og regulering af steroid 5a-reduktase, et enzym, der er afgørende for mandlig seksuel differentiering. Journal of Biological Chemistry, 264: 16249-16255.
14. Andersson S, Berman DM, Jenkins EP & Russell DW (1991). Deletion af steroid 5a-reduktase 2 genet i mandlig pseudohermafroditisme. Nature, 354: 159-161.
15. Harris G, Azzolina B, Baginsky W, Cimis G, Rasmusson G, Tolman R, Raetz C & Ellsworth K (1992). Identifikation og selektiv hæmning af et isoenzym af steroid 5a-reduktase i menneskelig hovedbund. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 89: 10787-10791.
16. Lobo RA, Goebelsmann U & Horton R (1983). Bevis for betydningen af perifere vævsbegivenheder i udviklingen af hirsutisme ved polycystisk ovariesyndrom. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 57: 393-397.
17. Serafini P & Lobo RA (1985). Forhøjet 5-reduktaseaktivitet i idiopatisk hirsutisme. Fertilitet og sterilitet, 43: 74-78.
18. Mestayer CH, Berthaut I, Portois M-C, Wright F, Kuttenn F, Mowszowicz I & Mauvais-Jarvis P (1996). Overvejende ekspression af 5a-reduktase type 1 i skamhud fra normale personer og hirsute patienter. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 81: 1989-1993.
19. Luu-The V, Sugimoto Y, Puy L, Labrie Y, Solache IL, Singh M & Labrie F (1994). Karakterisering, ekspression og immunohistokemisk lokalisering af 5a-reduktase i human hud. Journal of Investigative Dermatology, 102: 221-226.
20. Eicheler W, Dreher M, Hoffmann R, Happle R & Aumüller G (1995). Immunohistokemisk bevis for differentiel fordeling af 5a-reduktase-isoenzymer i menneskelig hud. British Journal of Dermatology, 133: 371-376.
21. Chen W, Zouboulis CC, Fritsch M, Blume-Peytavi U, Kodelja V, Goerdt S, Luu-The V & Orfanos CE (1998). Bevis for heterogenitet og kvantitative forskelle i ekspressionen af type 1 5a-reduktase i dyrkede humane hudceller: bevis for dens tilstedeværelse i melanocytter. Journal of Investigative Dermatology, 110: 84-89.
22. Bayne EK, Flanagan J, Flanagan J, Einstein M et al. (1999). Immunohistokemisk lokalisering af type 1 og 2 5a-reduktase i menneskelig hovedbund. British Journal of Dermatology, 141: 481-491.
23. Sawaya ME & Price VH (1997). Forskellige niveauer af 5a-reduktase type I og II, aromatase og androgenreceptor i hårfollikler hos kvinder og mænd med androgenetisk alopeci. Journal of Investigative Dermatology, 109: 296-300.
24. Courchay G, Boyera N, Bernard BA & Mahe Y (1996). Messenger RNA-ekspression af steroidogeneseenzymundertyper i den menneskelige pilosebaceous enhed. Skin Pharmacology, 9: 169-176.
25. Adams J, Franks S, Polson DW, Mason HD, Abdulwahid N, Tucker M, Morris DV, Price J & Jacobs HC (1985). Multifollikulære ovarier: kliniske og endokrine træk og respons på pulserende gonadotropinfrigivende hormon. Lancet, 2: 1375-1379.
26. Herter LD, Magalhães JA & & Spritzer PM (1996). Relevans af bestemmelse af ovarievolumen hos teenagepiger med menstruationsforstyrrelser. Journal of Clinical Ultrasound, 24: 243-248.
27. Spritzer PM, Oppermann-Lisboa K, Mattiello S & Lhullier F (2000). Anvendelse af spironolacton som enkeltmiddel til langtidsbehandling af hirsutroende patienter. Clinical Endocrinology, 52: 587-594.
28. Spritzer PM, Billaud L, Thalabard J, Thalabard J, Kuttenn F & Mauvais-Jarvis P (1990). Cyproteronacetat versus hydrokortisonbehandling ved sent indsættende binyrebarkhypoplasi. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 70: 642-645.
29. Azziz R, Dewailly D & Owerbach D (1994). Ikke-klassisk binyrebarkhypoplasi: aktuelle koncepter. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 78: 810-815.
30. Ferriman D & Gallwey JD (1961). Klinisk vurdering af kropsbehåringsvækst hos kvinder. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 21: 1140-1148.
31. Reis FM, Maia AL, Ribeiro MFM & Spritzer PM (1999). Progestinmodulation af c-fos- og prolaktin-genekspression i det humane endometrium. Fertility and Sterility, 71: 1125-1132.
32. Taplin ME, Bubley GJ, Shuster TD, Frantz ME, Spooner AE, Ogata GK, Keer HN & Balk SP (1995). Mutation af androgen-receptorgenet i metastatisk androgenuafhængig prostatacancer. New England Journal of Medicine, 332: 1393-1398.
33. Eicheler W, Huth A, Happle R & Hoffmann R (1996). RNA-niveauer af 5a-reduktase og androgenreceptor i menneskelig hud, hårfollikler og follikelafledte celler. In: Van Neste DJJ & Randall VA (Redaktører), Hair Research for the Next Millenium. Elsevier Science, Amsterdam, 327-331.
34. Schweikert HU & Wilson JD (1974). Regulering af menneskelig hårvækst ved hjælp af steroidhormoner. I. Testosteronmetabolisme i isolerede hårstrå. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 38: 811-819.
35. Kaufman KD, Olsen EA, Olsen EA, Whiting D et al. (1998). Finasterid i behandlingen af mænd med androgenetisk alopeci. Finasteride Male Pattern Hair Loss Study Group. Journal of the American Academy of Dermatology, 39: 578-589.
36. Tartagni M, Schonauer LM, De Salvia MA, Cicinelli E, De Pergola G & D’Addario V (2000). Sammenligning af Diane 35 og Diane 35 plus finasterid i behandlingen af hirsutisme. Fertility and Sterility, 73: 718-723.
37. Sahin Y, Diller S & Kelestimur F (2001). Sammenligning af Diane 35 og Diane 35 plus finasterid i behandlingen af hirsutisme. Fertilitet og sterilitet, 75: 496-500.
38. Rittmaster RS (1994). Finasteride. New England Journal of Medicine, 330: 120-125.
39. Asada Y, Sonoda T, Ojiro M, Kurata S, Sato T, Ezaki T & Takayasu S (2001). 5a-Reduktase type 2 udtrykkes konstitutivt i dermal papilla og bindevævsskeden af hårfolliklen in vivo, men ikke under dyrkning in vitro. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 86: 2875-2880.
40. Eicheler W, Happle R & Hoffmann R (1998). 5a-reduktaseaktivitet i den menneskelige hårfollikel koncentrerer sig i den dermale papil. Archives of Dermatological Research, 290: 126-132.