Overraskende opdagelse af en ny vej styret af Notch-signalprotein åbner døren for bedre lægemiddeludvikling
By Lindsay Brownell
(BOSTON) – Hvert minut pulserer halvanden liter blod gennem kroppens netværk af vener og arterier. Kraften i denne blodgennemstrømning er med til at holde de celler, der beklæder blodkarrene, kaldet endotelceller, sunde. Når blodgennemstrømningen forstyrres, f.eks. under kirurgiske indgreb eller et slagtilfælde, begynder karrene at lække, hvilket kan forårsage et væld af inflammatoriske reaktioner, der fører til celleskader og sygdom. Forskere ved Wyss Institute ved Harvard University satte sig for at løse mysteriet om, hvordan blodgennemstrømningen holder karrene intakte, og til deres overraskelse opdagede de en helt ny cellesignalvej, som er et lovende mål for lægemidler til behandling af en række svækkende tilstande.
“Vi fandt ud af, at det velkendte Notch-protein er ansvarlig for at forhindre, at blodkarrene bliver utætte, og at det sker gennem en sekundær signalvej, der fungerer på en helt anden måde end den kendte transkriptionsbaserede vej”, siger Chris Chen, M.D., Ph.D., Associate Faculty member of the Wyss Institute og Founding Director of the Biological Design Center and Distinguished Professor of Biomedical Engineering at Boston University, som er korresponderende forfatter af artiklen. “Denne nye vej er ikke kun spændende ud fra et opdagelsesperspektiv, den kan også forbedre nogle af bivirkningerne ved kræft- og hjerte-kar-medicin, så de bliver sikrere og mere effektive.” Undersøgelsen er offentliggjort i dag i Nature.
De endotelceller, der beklæder blodkarrene, er tæt forbundet med hinanden gennem forbindelser kaldet adherens junctions for at danne en barriere, der holder blodet inde i karret og regulerer, hvor let andre stoffer kan passere ind og ud af det. For at undersøge denne barriere og fastslå, hvorfor manglende blodgennemstrømning får den til at lække, byggede forskerne en blodkar-on-a-chip-model bestående af en kanal foret med et lag humane endotelceller omgivet af ekstracellulær matrix i en mikrofluidisk enhed, som gjorde det muligt for dem nemt at simulere og kontrollere blodgennemstrømningen gennem et kar og evaluere cellernes reaktioner.
Endotelceller, der oplevede blodgennemstrømning, viste øget aktivitet af transmembranproteinet Notch1, mens celler udsat for statisk blod ikke gjorde det. Da forskerne tilføjede et kemikalie, der blokerer Notch1-aktivering ved at forhindre dets intracellulære domæne i at løsne sig, observerede de, at karret begyndte at lække, hvilket de bestemte, at det skyldtes afbrydelsen af adherens-junctions mellem naboendothelceller og reorganiseringen af aktinfibre i hver enkelt celle. Dette bekræftede, at aktivering af Notch1 ved blodgennemstrømning er nødvendig for dannelse og vedligeholdelse af blodkarrenes endothelbarriere.
Mærkeligt nok fik det ikke karrene til at lække, når man forhindrede Notch1’s intracellulære domæne i at starte transkription efter løsrivelse (hvilket er Notch1’s veletablerede virkningsmekanisme), hvilket antydede, at en anden del af proteinet, hvis funktion ikke involverede transkription, reagerede på blodgennemstrømningen. Denne mistanke blev styrket af in vivo-forsøg, hvor forskerne injicerede mus med et kemikalie, der blokerede Notch1 sammen med blåt farvestof, og så, at farvestoffet lækkede ud af de behandlede mus’ blodkar med en meget hurtigere hastighed end forventet. “Det tager normalt omkring to timer at transskribere et gen til et protein, som derefter udfører en eller anden funktion i cellen, men vi så udsivning inden for 30 minutter, hvilket yderligere tyder på, at den proces, der styrer barrierenes permeabilitet, fungerer via en helt anden mekanisme”, siger Bill Polacheck, ph.d, Postdoctoral Fellow ved Wyss Institute og medforfatter af artiklen.
Når de havde fastslået, at det intracellulære domæne ikke var involveret i reguleringen af den endotheliale barriere, scannede forskerne andre dele af Notch1 for aktivitet. De brugte CRISPR/Cas-9 til at slette forskellige sektioner af Notch1-genet og fandt, at sletning af den sektion, der koder for det intracellulære domæne, ikke havde nogen effekt på permeabiliteten, mens sletning af den lille sektion af transmembrandomænet (TMD) også forårsagede en stigning i karlækage under flowforhold. “Det er første gang, at den biologiske funktion af Notch TMD’et nogensinde er blevet evalueret”, siger Matthew Kutys, Ph.D., der er gæsteforsker ved Wyss Institute og medforfatter på førstepladsen. “Det blev stort set antaget at være inaktivt og bare ligesom forsvinde efter aktivering, og de fleste lærebøger og forskningsartikler viser det ikke engang som en særskilt del af Notch-receptorer.” Gennem yderligere test fandt de ud af, at når Notch1 aktiveres, og dens intracellulære domæne frigives, samler dens TMD et kompleks i membranen med proteinerne VE-cadherin, Rac1, LAR og Trio, som tilsammen samler og opretholder adherens junctions mellem celler og distribuerer aktinfibre mod cellemembranen for at støtte disse junctions.
“Set i bakspejlet kastede vi terningerne med dette projekt, for ved at vælge at undersøge Notch gik vi ind på et af de mest overfyldte forskningsområder i biologien. Men vores ingeniørbaserede tilgang gjorde det muligt for os at studere det på en ny måde uden indflydelse eller fordomme fra tidligere arbejde, hvilket jeg tror er det, der gjorde os åbne nok til at observere og karakterisere denne nye, uventede vej”, siger Polacheck. “Viden om, at Notch1 regulerer celleadhæsion ud over celledifferentiering, giver også en ny ramme for forståelsen af koordineringen af komplekse cellulære processer, idet enkelte molekyler som Notch kan spille flere roller,” tilføjer Kutys.
Opdagelsen af, at Notch1 tjener forskellige funktioner, og viden om, hvilke dele af proteinet der styrer hver funktion, giver mulighed for udvikling af nye lægemidler, der både er mere effektive og mindre giftige. “Notch er et mål for nogle kræftterapier, men disse lægemidler er kendt for at forårsage ødemer og andre problemer. Nu arbejder vi aktivt på at adskille Notchs to veje, så vi kan skabe lægemidler, der udelukkende er rettet mod det intracellulære domæne og skåner TMD’en og dermed bevarer blodkarrenes integritet”, siger Karen Hirschi, ph.d., professor i medicin og genetik ved Yale School of Medicine, som har medvirket ved undersøgelsen. Viden om, at Notch styrer karpermeabilitet, gør det også til en kandidat til nye lægemidler til behandling af hjerte-kar-sygdomme, og holdet undersøger også TMD’en som et potentielt terapeutisk middel i sig selv, da cellemodeller, der blev udsat for lækageinducerende inflammation, viste en dramatisk reduktion af lækage, når de blev manipuleret til at udtrykke TMD’en.
“Det samarbejde, som Wyss Institute muliggør og fremmer mellem forskellige områder, f.eks. maskinteknik og molekylærbiologi, fremmer nye tilgange til gamle problemer, som kan føre til virkelig paradigmeskiftende resultater”, siger Donald Ingber, M.D. Ph.D., Wyss-instituttets stiftende direktør og Judah Folkman-professor i karbiologi ved Harvard Medical School og karbiologiprogrammet ved Boston Children’s Hospital, som også er professor i bioteknologi ved Harvard Paulson School of Engineering and Applied Sciences (SEAS). “Denne undersøgelse er et glimrende eksempel på de fordele, som disse typer partnerskaber kan give videnskaben og samfundet.”
Der er yderligere forfattere til undersøgelsen, bl.a. Jinling Yang, Ph.D., postdoc ved Wyss Institute; Jeroen Eyckmans, Ph.D., Ph.D., tidligere Wyss Postdoctral Fellow og nuværende gruppeleder ved Boston University; Yinyu Wu, kandidatstuderende ved Institut for Genetik på Yale; og Hema Vasavada, laboratoriechef ved Yale School of Medicine.
Denne forskning blev støttet af bevillinger fra National Institutes of Health (NIH), National Science Foundation (NSF), en Ruth L. Kirchstein National Research Service Award, The Hartwell Foundation og Wyss Institute at Harvard University.
- PUBLIKATION – Nature: Et ikke-kanonisk Notch-kompleks regulerer adherens junctions og vaskulær barrierefunktion