Konvertering af mRNA til dobbeltstrenget cDNA

Enzymatisk konvertering af mRNA til dobbeltstrenget indsat DNA kan opnås ved hjælp af en række forskellige procedurer. Alle involverer virkningen af omvendt transkriptase og oligonukleotid-primet syntese af cDNA. Herefter adskiller de almindeligt anvendte procedurer sig betydeligt fra hinanden. Der findes en række metoder til syntese af den anden streng og flere procedurer til fremstilling af passende ender til fremstilling af klonbart DNA. Hovedformålet med disse procedurer er at konstruere et så langt insert-DNA som muligt med et højt udbytte af konvertering af mRNA til DNA, der kan ligere til vektor-DNA. Følgende protokoller kræver kun kommercielt tilgængelige reagenser og er normalt gode til at fremstille gode cDNA-biblioteker. Grundprotokollen beskriver en metode til fremstilling af cDNA med stumpe ender, som derefter kan ligeres til linkere med henblik på efterfølgende kloning i et unikt restriktionssted som EcoRI. Den alternative protokol er en variation, der kræver færre enzymatiske manipulationer og gør det muligt at konstruere retningsbestemte cDNA-biblioteker, hvilket er særlig ønskeligt, når målet er at generere ekspressions-cDNA-biblioteker. Den alternative protokol udnytter en linker-primer bestående af (i rækkefølge fra 3′ til 5′) en oligo(dT)-primer, et restriktionssted for XhoI-endonukleasen og en (GA)20-repeat til beskyttelse af restriktionsstedet under frembringelsen af cDNA med stumpe ender. De interne XhoI-steder på de enkelte cDNA-molekyler er beskyttet ved at inkorporere 5-methyl-dCTP i første-strengs nukleotidblandingen. De resulterende cDNA’er med unikke ender kan klones i EcoRI/XhoI-fordøjede vektorer efter ligering af EcoRI-adaptorer til 5′-enden og fordøjelse med XhoI for at frigøre de 3’XhoI-steder, der blev inkorporeret i cDNA’et af linker-primeren. Disse ændringer resulterer i en betydeligt strømlinet procedure, som er væsentligt hurtigere og lettere end den grundlæggende protokol.