Virus og celler
Medmindre andet er angivet, blev alle eksperimenter udført med et klinisk influenzavirusisolat i MDCK-celler A/Memphis/14/96-M (H1N1), venligst stillet til rådighed af Dr. Robert Webster (St. Jude Children’s Hospital, USA) . De vira, der er beskrevet i fig. 5, blev venligst stillet til rådighed af de kolleger, der er anført i takkekortet.
MDCK-celler og MDCK-SIAT1-celler stabilt transficeret med 2,6-sialyltransferase til øget ekspression af Neu5Ac2-6Gal-terminerede oligosaccharider blev tidligere beskrevet . Vi opformerede begge celletyper i DMEM (Gibco) suppleret med 2 mM L-glutamin, 10 % føtal kalveserum og antibiotika (streptomycin, 100 mg/ml og penicillin, 100 U/ml).
Overlay-medier
Som flydende vedligeholdelsesmedium (MM) til virusinfektion anvendte vi Eagle’s MEM, der indeholdt L-glutamin, 0,1 % BSA (Sigma, A-0336), antibiotika og 1 μg/ml TPCK trypsin (Sigma, T-1426).
Stocks af 1,8 % Bacto-Agar (BD, 214010) og 2 % methylcellulose (Methocel MC, 3000-5500 mPa.s ved 2 %, Fluka) i destilleret vand blev fremstillet som tidligere beskrevet .
Producenten af Avicel RC/CL (FMC BioPolymer) stillede venligst tre typer Avicel (RC-581, RC-591 og CL-661) til rådighed til afprøvning. Vi fremstillede stam-suspensioner af Avicel ved at dispergere 2,4 g Avicel-pulver i 100 ml destilleret vand på en standardmagnetomrører i 1 time. Agar, MC og Avicel-lagre blev steriliseret ved autoklavering i 20 min. ved 121 °C og opbevaret ved stuetemperatur.
Overlayerne blev fremstillet ved at blande lageropløsninger af MC, Avicel eller smeltet agar med lige store mængder dobbeltstyrket vedligeholdelsesmedium. For at variere koncentrationen af MC og Avicel i overlejringerne fortyndede vi de oprindelige lagre med sterilt vand. Agaroverlejringen blev fremstillet ved 42-44 °C, mens to andre overlejringer blev fremstillet ved enten 20 eller 37 °C.
Koncentrerede (2,4 %) Avicel-lagre skiltes typisk ikke under opbevaring, fortyndede Avicel-baserede overlejringer var imidlertid mindre stabile. Hvis det blev anset for nødvendigt, blandede vi Avicel-stocks, og vi blandede altid Avicel-overlays før brug ved enten at ryste med hånden eller vortexe dem. Langsom adskillelse af overlays efter deres påføring på cellemonolag havde ingen indflydelse på analyseresultaterne.
Plaque assay i 6-well plates
En time efter at have inficeret cellemonolagene med 30-50 plakformende enheder af virus i 1 ml vedligeholdelsesmedium uden trypsin, fjernede vi virusinokulummet, dækkede cellerne med 3 ml af de forskellige overlay-medier og inkuberede kulturerne ved 35 °C i en 5 % CO2-atmosfære. I tilfælde af MC- og Avicel-overlays blev der sørget for ikke at forstyrre pladerne i inkubationsperioden for at undgå dannelse af ujævne plaques. Efter tre dages inkubation fjernede vi overlaysene og fikserede cellerne. Agaroverlejringen blev fjernet ved hjælp af en metalspatel; MC-, Avicel- og væskeoverlejringer blev fjernet ved hjælp af sugekraft. Cellerne blev fikseret med 4 % paraformaldehydopløsning i MEM i 30 minutter ved 4 °C og skyllet med PBS. Alle efterfølgende behandlinger af cellerne blev udført ved stuetemperatur. Vi permeabiliserede cellerne og blokerede samtidig resterende aldehydgrupper ved at inkubere cellerne i 10-20 min med 1 ml/brønd af en opløsning indeholdende 0,5 % Triton-X-100 og 20 mM glycin i PBS. Vi immunfarvede virusinficerede celler ved at inkubere i 1 time med monoklonale antistoffer, der er specifikke for influenza A-virus-nukleoproteinet (venligst stillet til rådighed af Dr. Alexander Klimov fra Centers for Disease Control, USA), efterfulgt af 1 times inkubation med peroxidasemærkede anti-mus-antistoffer (DAKO, Danmark) og 30 minutters inkubation med udfældningsdannende peroxidasesubstrater. Der blev anvendt en opløsning af 10 % normalt hesteserum og 0,05 % Tween-80 i PBS til fremstilling af arbejdsfortyndinger af immunreagenser. Vi vaskede cellerne efter de primære og sekundære antistoffer ved at inkubere dem tre gange i 3-5 min. med 0,05% Tween-80 i PBS. Som peroxidasesubstrater anvendte vi enten klar til brug True Blue™ (KPL) eller opløsning af aminoethylcarbazol (AEC, Sigma) (0,4 mg/ml) fremstillet i 0,05 M natriumacetatbuffer, pH 5,5 og indeholdende 0,03 % H2O2. De farvede plader blev vasket med vandhanevand for at stoppe reaktionen og tørret. I tilfælde af True Blue-farvning, som er relativt ustabil i vandopløsninger, blev pladerne tørret på hovedet for at minimere blegning. Farvede plader blev scannet på en fladskærmsscanner, og dataene blev erhvervet med Adobe Photoshop 7.0-software.
Som et alternativ til immunfarvning afslørede vi i nogle eksperimenter plaques som områder med ødelagte celler. Til dette formål farvede vi cellerne efter at have fjernet overlejringerne med 1% krystalviolet opløsning i 20% methanol i vand.
Varianter af virustitrering i 96-well-plader
1. Standardvariant
Vi inficerede MDCK- eller MDCK-SIAT1-cellemonolag i 96-well-plader med 50 μl/well af serielle fortyndinger af virus i vedligeholdelsesmediet uden trypsin. Efter 1 times inkubation ved 35 °C i 5 % CO2 fjernede vi virussen, tilsatte 100 μl/well af enten MC- eller Avicel-overlay-medie og inkuberede cellerne i yderligere 24 timer for at tillade plakedannelse. Fiksering og immunfarvning blev udført som beskrevet ovenfor for 6-hulsplader, men med 50 μl reagenser pr. brønd.
2. Forenklet variant
Assayet blev udført nøjagtigt som i standardvarianten med følgende ændringer. Efter 1 times inkubation med viruset fjernede vi ikke inokulumet. Vi tilføjede 100 μl/brønd Avicel-overlay-medie og blandede pladen enten ved at banke med hånden eller ved hjælp af en plademixer. Medierne indeholdt øgede mængder trypsin (1,5 μg/ml) for at kompensere for fortyndingen af overlayet med det virusholdige materiale, der var til stede i brøndene.
Plakehæmningsassay
Noel Roberts (Roche Products, UK) har venligst stillet neuraminidasehæmmeren oseltamivircarboxylat (OC) til rådighed. Vi tilføjede 50 μl/hul af serielle 10-dobbelte fortyndinger af OC i vedligeholdelsesmedium uden trypsin (koncentrationsinterval fra 4 nM til 400 μM OC) til monolag af MDCK-SIAT1-celler i 96-hulsplader. Derefter blev der tilsat 50 μl/brønd af virusfortyndinger (20-40 plakdannende enheder pr. brønd). Vi blandede pladen og inkuberede den i 1 time ved 35 °C for at tillade initiering af virusinfektion. Derefter tilføjede vi 100 μl/brønd af 1,2 % Avicel-overlay-medie indeholdende 2 μg/ml trypsin, inkuberede kulturerne i 24 timer og fikserede og immunfarvede dem som beskrevet ovenfor.
For 6-hulsplader tilføjede vi 0,75 ml alikvater af lægemidlet og inhibitoren og 1,5 ml alikvat af Avicel pr. brønd og immunfarvede plakkerne 3 dage efter infektion.