- Hypoxi forårsager en stigning i ekspressionen af M. smegmatis recA- og recX-gener
- Konstruktion af ΔrecX- og ΔrecA ΔrecX-mutantstammer
- Genotypisk og fænotypisk analyse af M. smegmatis ΔrecX- og ΔrecAΔrecX-mutanter
- De M. smegmatis ΔrecA- og ΔrecA ΔrecX-mutantstammer viser nedsat vækst og reduceret celleudbytte i forhold til wildtypestammen
- Deletion af recA, men ikke recX, gør M. smegmatis mere modtagelig over for DNA-skadelige stoffer
- Overlevelse efter behandling med forskellige koncentrationer af DNA-skadelige stoffer
- Ekspressionen af recA- og recX-gener induceres af DNA-skader
- Slutbemærkninger
- De anvendte forkortelser er
Hypoxi forårsager en stigning i ekspressionen af M. smegmatis recA- og recX-gener
Under infektions- og proliferationsforløbet udsættes M. tuberculosis for fysiologiske stressbetingelser såsom hypoxi og sur pH-stress, hvilket kan bringe dens overlevelse i fare38,39,40. Akut hypoxisk stress standser f.eks. DNA-replikationen og udløser robuste DNA-skader41,42,43. En stigning i ekspressionen af generne i SOS-vejen, herunder umuDC, polB, recN, sulA, uvrA, uvrB og uvrD, begynder ved DNA-skader44,45,46. I den forbindelse har hypoxi-induceret genekspressionsprofilering i M. smegmatis og M. tuberculosis under latent infektion givet værdifuld indsigt i karakteren af latente tuberkelbaciller og behandlingen heraf47.
Fremtidige undersøgelser i M. tuberculosis48, Thiobacillus ferrooxidans49 og Streptomyces lividans50 har vist, at recA er co-transskriberet med recX. Endvidere blev det konstateret, at en overekspression af RecA (en positiv regulator af SOS-respons) var toksisk i fravær af RecX i visse bakteriearter, herunder Pseudomonas aeruginosa51, S. lividans50, M. smegmatis52 og Xanthomonas oryzae53. Disse resultater er i overensstemmelse med den opfattelse, at RecX fungerer som en anti-rekombinase for at dæmme op for uhensigtsmæssige rekombinationsbegivenheder, der fremmes af RecA14. I modsætning hertil er en overekspression af RecA i E. coli ΔrecX-stammen ikke skadelig, og deletion af recX påvirker ikke recA-ekspressionen54. RecX-transkriptionen i E. coli er nedreguleret i forhold til recA under normale vækstbetingelser på grund af eksistensen af et transkriptionstermineringssted mellem de recA- og recX-kodningssekvenser. Et recA-recX mRNA-transkript, der er resultatet af transkriptionel read-through, akkumuleres imidlertid i størrelsesordenen 5-10 % af det samlede recA mRNA-indhold54. RecX-transkriptet kunne næsten ikke påvises under den vegetative vækst af E. coli, men der forekommer en robust ekspression af recX efter behandling med DNA-skadende stoffer15,55.
Den genomiske arvemasse af både M. smegmatis og M. tuberculosis indeholder en enkelt kopi af hver af recA og recX i et enkelt operon. For at undersøge ekspressionen og reguleringen af disse gener under aerob og hypoxisk vækst i M. smegmatis, en almindeligt anvendt surrogatmodel for M. tuberculosis, blev den relative abundans af mRNA i forskellige vækstfaser målt ved hjælp af et RT-qPCR-assay og normaliseret i forhold til den relative abundans af det konstitutivt udtrykte 16S rRNA-gen. Ct-værdierne (cycle threshold) for M. smegmatis recA- og recX-mRNA blev normaliseret i forhold til Ct-værdien for 16S rRNA-genet. I modsætning til E. coli15,55 blev der set en betydelig mængde recA mRNA-transskriptioner i den tidlige logfase under både aerobe og hypoxiske kulturbetingelser (Fig. 1A). Interessant nok øgede hypoxiske forhold akkumuleringen af recA mRNA med 1,5 gange ved midten af logfasen og faldt derefter, da cellerne gik ind i den stationære fase. Der blev observeret et lignende mønster med recX mRNA-belægning under både aerobe og hypoxiske forhold, om end på reducerede niveauer (Fig. 1B). Disse observationer understøtter ideen om, at de to gener er co-transskriberet og koordineret reguleret under aerobe og hypoxiske vækstbetingelser. Det er interessant, at der ikke blev set nogen forskel i mængden af mRNA under aerobe og hypoxiske vækstbetingelser i den tidlige logfase. Transkriptionsprofilerne af M. smegmatis’ vækstfasespecifikke markørgener (sigH2 og sigH7)56 blev anvendt til at fastslå tidspunkterne for den tidlige log-, den mid-log- og den stationære fase (fig. 1C). I multiresistente kliniske stammer af M. tuberculosis blev det konstateret, at niveauerne af både recA- og recX-mRNA var højere end i de lægemiddelmodtagelige stammer, og niveauerne af recX-mRNA steg samtidig med en stigning i recA-mRNA57.
(A,B) Relative niveauer af ekspression af M. smegmatis mc2155 recA- og recX-generne i den tidlige log-, mid-log- og stationære fase under aerobe og hypoxiske vækstbetingelser. (C) Relative ekspressionsniveauer for sigH2- og sigH7-generne i den tidlige log-, mid-log- og stationære fase. Signalintensiteterne blev bestemt som beskrevet i afsnittet Metoder. Histogrammerne repræsenterer middelværdierne for tre uafhængige eksperimenter. Ekspressionsniveauerne blev bestemt og normaliseret i forhold til ekspressionen af 16S ribosomalt RNA, og induktionsforholdet blev beregnet i forhold til mængden af transkript i den aerobe kultur i den tidlige logfase. Fejlstængerne repræsenterer standardfejlen af gennemsnittet beregnet ud fra 3 uafhængige replikater.
Det skal dog bemærkes, at mRNA-niveauerne ikke kan anvendes som surrogater for de tilsvarende proteinniveauer. Derfor blev mængden af RecA- og RecX-proteiner i M. smegmatis målt under aerobe og hypoxiske forhold ved hjælp af en Western Blot-analyse med anti-RecA- og anti-RecX-antistoffer. GroEL blev undersøgt som en proteinbelastningskontrol. Den densitometriske analyse af immunoblots viste, at cellerne akkumulerede højere niveauer af RecA under hypoxiske vækstbetingelser sammenlignet med aerobe betingelser (Fig. 2A,B). En sammenlignende analyse viste, at cellerne konsekvent akkumulerede 2 gange højere niveauer af RecA i midten af logfasen i forhold til den tidlige logfase under aerobe vækstbetingelser, hvilket faldt i den stationære fase til niveauer set i den tidlige logfase (Fig. 2A,B). Et lignende mønster blev observeret for RecX, selv om niveauerne var mindre udtalt end for RecA (Fig. 2A,C). Selv om mRNA- og proteinekspressionsmønstrene var sammenlignelige, blev der konstateret vigtige forskelle. For det første var RecX-proteinet næppe påviseligt i den tidlige logfase under hypoxiske forhold. For det andet var overfloden af RecA mRNA og -protein højere sammenlignet med RecX.
(A) Ekspressionsniveauer af M. smegmatis mc2155 RecA- og RecX-proteiner under aerobe og hypoxiske vækstbetingelser. (B) Kvantificering af relative ændringer i RecA-proteinniveauer under aerobe og hypoxiske vækstbetingelser. (C) Kvantificering af de relative ændringer i RecX-niveauet under aerobe og hypoxiske vækstbetingelser. Histogrammerne repræsenterer de gennemsnitlige værdier bestemt ved kvantificering af Western Blots fra tre uafhængige eksperimenter. Belastningskontrollen GroEL blev anvendt til normalisering af RecA- og RecX-ekspressionsniveauer. Fejlstængerne repræsenterer standardfejlen af middelværdien beregnet ud fra 3 uafhængige gentagelser. Signifikante forskelle er angivet med **p < 0,01 og *p < 0,05. ns, ikke signifikant.
Selv om disse resultater tyder på, at M. smegmatis recA- og recX-generne induceres under hypoxiske forhold, er der ingen korrelation mellem mængden af recX mRNA og det tilsvarende protein i den tidlige logfase. Både M. tuberculosis og M. smegmatis har vist sig at stabilisere deres mRNA-transskriptioner under væksthæmmende forhold58,59,60. Blandt mulige mekanismer er tRNA-omprogrammering og selektiv kodon-biased translation blevet vist at spille en rolle i mykobakterier som reaktion på hypoxi61. En mulig forklaring på den manglende korrelation mellem recX mRNA- og proteinniveauet i den tidlige logfase kunne skyldes translationel repression af recX mRNA.
Konstruktion af ΔrecX- og ΔrecA ΔrecX-mutantstammer
Den forskel i RecA- og RecX-proteinniveauet i M. smegmatis indikerer en mulig regulering af genekspression på transkriptionsniveau. I mange bakterier, der hidtil er blevet undersøgt, er recX-genet placeret på den samme kodningsstreng nedstrøms for recA, og de to gener er samtransskriberet48,50,53,54,54,62,63. I lexA-recA-recX-lokusset hos Xanthomonas pathovars udtrykkes hvert gen imidlertid fra sin egen promotor64. Endvidere er recA- og recX-generne i D. radiodurans65,66, B. subtilis67 og N. gonorrhoeae26 adskilt af flere hundrede kb i længden og transskriberet fra deres egne promotorer.
I en række mykobakteriearter samt i nogle få andre bakterier overlapper 5′-regionen af den recX-kodende sekvens 3′-regionen af recA-genet. Overlapningen er 32 bp lang i M. smegmatis48 , mens den i M. tuberculosis68 og M. leprae69 er 35 bp lang. Virkningen af recX-deletion på de fænotypiske egenskaber er blevet undersøgt i forskellige organismer7,10. Knockoutmutanterne af recX viser en række fænotyper, der er forbundet med RecA-funktioner: inaktivering af B. subtilis recX gjorde cellerne følsomme over for MMS og H2O225 , S. lividans recX-mutanterne viste nedsat modstandsdygtighed over for UV-skader42 , og N. gonorrhoeae recX-mutanten viste et lille fald i sin evne til at overleve DNA-skader, der blev forårsaget af dobbeltstrengebrud26. Virkningen af deletion af både recA- og recX-generne på vækstkarakteristika og reparation af DNA-skader er imidlertid ikke blevet undersøgt i nogen organisme. Desuden er der ikke fuld forståelse af recX’s in vivo-rolle i mykobakterier.
Fremtidige undersøgelser har vist, at M. smegmatis ΔrecA-stammen udviste følsomhed over for UV-inducerede DNA-skader og undlader at fremme HR52. Vi kombinerede recA-mutationen med deletion af recX for at undersøge virkningerne af de dobbelte mutationer. Til dette formål blev der genereret M. smegmatis mc2155 recX enkelt- og recArecX-dobbeltmutantstammer. Som en kontrol blev virkningen af recA-deletion i M. smegmatis revurderet til direkte sammenligning. Ved hjælp af rekombinationsmetoden, som er baseret på en protokol udviklet til M. tuberculosis og M. bovis BCG28, blev M. smegmatis mc2155 ΔrecA- og ΔrecAΔrecX-mutanterne genereret ved hjælp af henholdsvis 3,279 kb og 3,302 kb lineære ΔrecA::hyg- og ΔrecAΔrecX::hyg-AES-konstruktioner. Ca. 100 ng af lineære AES-DNA-fragmenter blev genereret ved restriktion fordøjelse af de respektive plasmider med EcoRV (Fig. 3A). Disse blev transformeret til kompetente M. smegmatis mc2155:pJV53-rekombinationsceller70. Efter 4-5 dages inkubation blev der fundet 8-10 Hyg-resistente kolonier for ΔrecX- og ΔrecAΔrecX-mutanterne. De formodede mutantstammer blev screenet ved hjælp af PCR for at bestemme, om recX- og recArecX-generne blev slettet fra kromosomet (data ikke vist). De korrekte mutanter blev dyrket i 7H10 Middlebrook agarmedium i 5-8 generationer for at tillade tab af pJV53.
Isolering af M. smegmatis mc2155 ΔrecX- og ΔrecA ΔrecX-mutantstammer fra M. smegmatis mc2155. (A) fysisk kort over M. smegmatis recA recX-, ΔrecAΔrecX- og ΔrecX-regionerne. De vandrette linjer med pilespidser i begge ender repræsenterer størrelsen af det genomiske DNA-fragment mellem NdeI- og SalI-restriktionsstederne svarende til wild-type-, ΔrecA ΔrecX- og ΔrecX-stammerne. Lynsymbolerne angiver genkendelsessteder for de angivne restriktionsenzymer. De små sorte kasser (ved siden af NdeI-genkendelsesstedet) angiver de hybridiseringssonder, der er anvendt i Southern blotting-forsøg. (B) Southern Blot-analyse af genomisk DNA fra wild-type- og ΔrecX-stammer. Lane 1 og 4, molekylvægtmarkører; 2, genomisk DNA fra wildtypestammen; 3, genomisk DNA fra ΔrecX-stammen. (C) Southern Blot-analyse af genomisk DNA fra wild-type- og ΔrecAΔrecX-stammer. Lane 1, molekylvægtmarkører; 2, genomisk DNA fra wildtypestammen; 3, genomisk DNA fra ΔrecAΔrecX-dobbeltmutantstammen.
Genotypisk og fænotypisk analyse af M. smegmatis ΔrecX- og ΔrecAΔrecX-mutanter
Efter screening ved PCR blev der opnået 2 hver af ΔrecX- og ΔrecAΔrecX-knockoutmutanterne af M. smegmatis mc2155. ΔrecX- og ΔrecAΔrecX-mutanterne blev karakteriseret ved restriktionsenzymkortlægning og Southern Blot-hybridisering (fig. 3). Ved hybridisering med passende radiomærkede prober blev der set et 4,1 kb-fragment i tilfælde af wild-type M. smegmatis mc2155-celler. De forudsagte 3,14 kb- og 2,09 kb-fragmenter blev observeret i henholdsvis ΔrecX- og ΔrecAΔrecX-mutanterne (Fig. 3B,C). Begge disse bånd er mindre end 4,1 kb, hvilket indikerer, at recX- og recArecX-generne er blevet slettet ved allelisk udskiftning. Frekvensen af allelisk udveksling med hensyn til recX og recArecX var på henholdsvis 70 % og 80 %.
Et forbehold ved denne analyse er, at de observerede virkninger af ΔrecX- og ΔrecAΔrecX-mutationer kan skyldes de polære virkninger af hygromycinresistensgenindsættelse. Generelt kunne genetiske ændringer omkring recA-recX-lokusset føre til polære virkninger på ekspressionen af gener nedstrøms recA-recX-lokusset. Der blev udført to uafhængige eksperimenter for at undersøge de potentielle polære virkninger. For det første blev ΔrecX- og ΔrecAΔrecX-mutanterne suppleret med de funktionelle kopier af recA- og recX-generne. Transformanterne blev vurderet for deres evne til at vokse i et standardkulturmedium og beskytte mutantcellerne mod UV-stråling. Ti gange serielle fortyndinger blev spottet på 7H10 agarplader og analyseret. Som vist i fig. 4A,B supplerede wild-type recA delvist ΔrecA- og ΔrecAΔrecX-mutantstammerne, som det fremgik af deres evne til at understøtte vækst og yde beskyttelse mod UV-stråling. Imidlertid lykkedes det ikke wild-type recX at redde fænotypen af ΔrecAΔrecX-mutantstammer, der blev observeret ved induktion af DNA-skader med UV-stråling. Da deletion af recX ikke havde nogen mærkbar virkning på dens vækst under normale og DNA-skadelige forhold, viste ΔrecX og den tilsvarende komplementerede stamme tilsvarende vækst som vildtypen.
Insættelse af et hygromycinresistensgen i M. smegmatis mc2155 recA-recX-lokus udøver ingen polær effekt. precA og precX betegner pVV16-vektor, der bærer en funktionel kopi af enten recA- eller recX-genet under kontrol af den konstitutive Hsp60-promotor. EV betegner pVV16 tom vektor. precA og precX angiver plasmider, der bærer wildtypekopier af henholdsvis M. smegmatis recA- og recX-generne. Disse er blevet transformeret til de angivne wild-type- og mutantstammer. Komplementering af M. smegmatis mc2155ΔrecA ΔrecX- og ΔrecX-mutantstammer med hensyn til aerob vækst (panel A) og følsomhed over for UV-stråling (panel B) med plasmider, der bærer wild-type alleler af M. smegmatis recA eller recX. (C), kvantitativ realtids-PCR-analyse af gener omkring recA-recX-lokusset i M. smegmatis mc2155-wildtypestammer og mutantstammer. Fejlstængerne repræsenterer standardfejlen af gennemsnittet beregnet ud fra 3 uafhængige gentagelser. Signifikante forskelle er angivet med ns, ikke signifikant.
For det andet vurderede vi ekspressionen af to M. smegmatis mc2155 generne gluD (MSMEG_2725) og glnH (MSMEG_2726), der er placeret nedstrøms for recA recX locus i ΔrecA ΔrecX og ΔrecX mutantstammerne i sammenligning med wildtypestammen. M. smegmatis hyd2-genet (MSMEG_2720), der er placeret opstrøms for recA-recX-lokussen, blev anvendt som en positiv kontrol. Det samlede RNA blev fremstillet fra wild-type-, ΔrecA ΔrecA ΔrecX- og ΔrecX-mutantstammer. Den relative hyppighed af gen-transskriptionerne blev bestemt ved kvantitativ RT-qPCR og normaliseret i forhold til det konstitutivt udtrykte kromosomale 16S rRNA-gen. Ekspressionsniveauerne blev målt fra celler, der var dyrket i den sene eksponentielle vækstfase. I alle tilfælde var genekspressionsprofilerne for både opstrøms- og nedstrøms-ORF’erne ens for wild-type- og mutantstammerne (Fig. 4C). Samlet set udelukker disse resultater muligheden for, at indsættelse af hygromycinresistensgenet forårsager polære effekter.
De M. smegmatis ΔrecA- og ΔrecA ΔrecX-mutantstammer viser nedsat vækst og reduceret celleudbytte i forhold til wildtypestammen
For at karakterisere M. smegmatis ΔrecX- og ΔrecA ΔrecX-mutantstammer blev vækstprofilerne for wild-type- og knockout-stammerne målt i 7H9 Middlebrook-bouillon ved 37 °C (fig. 5). RecX-deletionen havde ingen mærkbar effekt (sammenlignet med vildtypestammen) på væksten af M. smegmatis. Under lignende betingelser øgede recA-deletion markant længden af forsinkelsesfasen og reducerede samtidig den eksponentielle vækstfase, hvilket tyder på, at recA spiller en rolle for væksten og levedygtigheden af M. smegmatis. Desuden er disse resultater i overensstemmelse med RecA’s kendte funktion i forbindelse med redning af fastlåste eller kollapsede replikationsgafler71,72,73. Da recA- og recX-generne danner et enkelt operon, blev virkningen af deres deletion på M. smegmatis’ vækst undersøgt. ΔrecA ΔrecX knockout-stammen udviste en vækstfænotype, der lå mellem ΔrecA-mutanten og vildtypestammen; væksten i sene log- og stationære faser lignede dog den for ΔrecA- og vildtypestammene.
Kinetikken af væksten af M. smegmatis mc2155 wild-type, ΔrecA og ΔrecA ΔrecA ΔrecX- og ΔrecX-stammer under normale vækstbetingelser. Hvert datapunkt er gennemsnittet af tre uafhængige eksperimenter, og fejlstregningerne repræsenterer standardafvigelser af middelværdierne.
Deletion af recA, men ikke recX, gør M. smegmatis mere modtagelig over for DNA-skadelige stoffer
I lighed med andre eubakterier spiller det mykobakterielle RecA-protein en afgørende rolle i reguleringen af SOS-responset ved DNA-skader74,75,76,77. For at teste, om fraværet af recArecX og recX påvirker M. smegmatis’ evne til effektivt at reparere beskadiget DNA, blev mutanterne udsat for en række agenser med varierede mekanismer for DNA-skader. I disse eksperimenter blev stress induceret ved at udsætte ΔrecA-, ΔrecX- og ΔrecA ΔrecX-mutantstammerne for UV-stråling, MMS, H2O2 eller ciprofloxacin i den eksponentielle fase (OD600 på 0,6) af bakterievæksten. Efter 3 timers inkubation blev cellerne vasket, og deres levedygtighed blev undersøgt ved at plette ti gange serielle fortyndinger af kulturerne på Middlebrook 7H10 agarplader indeholdende hygromycin (100 µg/ml). Den mest hensigtsmæssige koncentration/dosis af de DNA-skadelige stoffer blev bestemt efter at have vurderet forskellene i celleviabilitet mellem stammerne ved hjælp af pladeassays. I fravær af DNA-skadelige stoffer udviste alle stammerne samme niveau af celleviabilitet (fig. 6). I modsætning hertil udviste ΔrecA-stammen i tilstedeværelsen af DNA-skadelige stoffer en udtalt vækstdefekt ledsaget af et 100-foldigt fald i udpladningseffektiviteten i forhold til wildtypestammen. Denne fænotype er i overensstemmelse med den tilgængelige litteratur. Derimod blev den dødelige virkning af UV, MMS eller ciprofloxacin, men ikke H2O2, delvist blokeret af deletion af recX-genet i ΔrecA-stammen. Selv om grundlaget for den manglende H2O2-effekt ikke er klart, var den anvendte koncentration sandsynligvis ikke høj nok til at påvirke væksten. Interessant nok udviste ΔrecX-stammen en lidt mere resistent fænotype over for alle fire DNA-skadelige stoffer end ΔrecA ΔrecX-stammen, hvilket tyder på en mulig gevinst af funktion som følge af tab af recX-genet. På baggrund af disse resultater er det tydeligt, at recA spiller en aktiv rolle i SOS-responset, og at følsomheden over for DNA-skadelige stoffer er en smule undertrykt i ΔrecX-stammen.
Effekt af DNA-skadende stoffer på overlevelsen af M. smegmatis mc2155 wild-type og ΔrecA-, ΔrecA ΔrecX- og ΔrecX-stammer. Pladerne blev udsat for: (A) 5 J/m2 UV-lys; (B) 0,01 % MMS; (C) 1 mM H2O2 og (D) 5 μM ciprofloxacin. Kontrol repræsenterer vækst af stammer uden DNA-skadende stoffer. Resultaterne er repræsentative data (n = 3) fra tre uafhængige eksperimenter.
Overlevelse efter behandling med forskellige koncentrationer af DNA-skadelige stoffer
Mycobakterier oplever en række ugunstige stressbetingelser, såsom oxidativ, ernæringsmæssig og lægemiddelinduceret stress78,79,80,81,82. For yderligere at undersøge forskelle i celleviabilitet blev der udført forsøg, hvor celleviabiliteten blev målt ved hjælp af kolonidannende enheder (CFU’er). Først blev levedygtigheden af M. smegmatis mc2155 ΔrecA-, ΔrecX- og ΔrecAΔrecX-mutanterne testet i sammenligning med den vilde type ved at udfordre dem med stigende koncentrationer af MMS. Stammerne blev dyrket i nærvær af de angivne koncentrationer af MMS, indtil kulturerne nåede en OD600 på 0,6. Cellens levedygtighed blev undersøgt ved at udplante et forudbestemt antal celler på 7H10 agarplader. Cellerne blev vurderet som levende, hvis de var i stand til at dele sig og danne kolonier. Mutanterne viste i modsætning til wildtypestammen en øget følsomhed over for MMS på en koncentrationsafhængig måde. Den kvantitative analyse viste, at ΔrecA-mutanten udviste en relativt højere følsomhed over for MMS, som steg med stigende koncentrationer af MMS (fig. 7A). I tilfælde af ΔrecX var cellerne ~2 gange mindre følsomme over for MMS sammenlignet med ΔrecA-cellerne. På den anden side viste ΔrecA ΔrecX-mutanten større følsomhed over for MMS i modsætning til ΔrecX-mutanten. ΔrecX-mutantens følsomhed over for MMS tyder på, at recX kan have endnu uidentificerede mål ud over RecA. Denne antagelse skal undersøges nærmere.
Survival af eksponentielle-fase kulturer udsat for et bredt spektrum af stigende koncentrationer af DNA-skadelige stoffer. Overlevelsen af M. smegmatis wild-type, ΔrecA, ΔrecA ΔrecA ΔrecX og ΔrecX-stammer blev undersøgt ved at bestemme antallet af CFU’er. (A) Overlevelsen af celler behandlet med (A), MMS; (B) H2O2; (C) UV-stråling og (D) ciprofloxacin. Fejlstængerne repræsenterer standardfejlen af gennemsnittet beregnet ud fra 3 uafhængige gentagelser. Signifikante forskelle er angivet med *p < 0,05; **p < 0,01 og ***p < 0,001. ns, ikke signifikant.
Dernæst blev følsomhederne af de M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX og ΔrecA ΔrecX mutantstammer i forhold til wildtypestammen blev bestemt ved at udsætte dem for stigende koncentrationer af H2O2. Resultaterne viser, at ΔrecA-mutanten var mindre følsom over for denne behandling (fig. 7B). Deletion af recX alene eller deletion af recA-recX locus havde kun en mindre effekt på mutantcellernes levedygtighed og proliferation som reaktion på H2O2-behandling. Især udviste ΔrecA- og ΔrecAΔrecX-mutantstammerne en følsom vækstfænotype over for UV-stråling og ciprofloxacin, som er betydeligt meget mere alvorlig end over for MMS eller H2O2 (fig. 7C,D). Desuden udviste ΔrecA-stammen større følsomhed over for UV-stråling og ciprofloxacin end ΔrecA ΔrecX-dobbeltmutantstammen.
Ekspressionen af recA- og recX-gener induceres af DNA-skader
De regulerende elementer opstrøms for recA-genet er ikke bevaret i alle mykobakteriearter. For eksempel er M. tuberculosis recA-genet transskriberet fra to promotorer: begge er DNA-skade-inducerbare, om end gennem forskellige mekanismer. Promotoren P1 af M. tuberculosis recA (proximalt i forhold til startkodonet) kan induceres efter DNA-skader uafhængigt af LexA- og RecA-proteinerne. I modsætning hertil reguleres promotoren P2 (placeret væk fra recA-startkodonet) af LexA, som funktionelt svarer til E. coli recA-promotoren83,84,85. Det er interessant, at mekanismen til induktion af DNA-skader i M. tuberculosis ikke er fuldt ud bevaret i M. smegmatis46,75. Disse resultater understreger behovet for at forstå ekspressionen og reguleringen af M. smegmatis recA- og recX-generne og deres rolle som reaktion på DNA-skadelige stoffer.
Som beskrevet ovenfor forårsagede hypoxi en stigning i ekspressionen af M. smegmatis recA- og recX-generne (Fig. 1). For yderligere at underbygge den opfattelse, at ekspressionen af M. smegmatis recA- og recX-generne er skadesinducerbar, blev kinetikken af induktion med og uden DNA-skader bestemt ved hjælp af RT-qPCR. Der blev fremstillet samlede RNA-prøver fra M. smegmatis-celler, der blev høstet 0, 3, 6, 9 og 12 timer efter eksponering for UV-lys samt fra ubehandlede kulturer, og de blev analyseret som beskrevet i afsnittet Metoder. Resultaterne viste ingen signifikante forskelle mellem recA- og recX-transkriptniveauerne i ubehandlede celler. Derimod blev der observeret en markant stigning i recA- og recX-mRNA-transskriptionerne 3 timer efter eksponering for UV-stråling, hvorefter de faldt en smule derefter. En sammenligning af RT-qPCR-dataene viser vigtige forskelle mellem recA- og recX-transkriptniveauerne. Eksponering for UV-stråling førte til en ~8-dobbelt stigning i recA mRNA i forhold til kontrol, mens recX steg ~3-dobbelt (Fig. 8A,B). Selv om recA og recX mRNA findes i den samme transkriptionelle enhed, understøtter disse resultater således ideen om, at produktionen og/eller stabiliteten af recX mRNA-transkriptet er underlagt en yderligere posttranskriptionel reguleringsmekanisme.
UV-stråling inducerer ekspression af recA og recX i M. smegmatis. (A) kinetik af akkumulering af recA mRNA i kontrol og efter eksponering for UV-stråling; (B) kinetik af akkumulering af recX mRNA i kontrol og efter eksponering for UV-stråling. (C) Repræsentative westernblots, der viser kinetikken af akkumulering af RecA- og RecX-proteiner i kontrolceller og UV-inducerede M. smegmatis-celler. (D,E) Kvantificeringer af Western blot-data vist i panel C. Fejlstængerne repræsenterer standardfejlen af gennemsnittet beregnet ud fra 3 uafhængige gentagelser.
Disse resultater fik os til at udføre yderligere eksperimenter for at bestemme kinetikken af akkumulering af RecA- og RecX-proteiner i M. smegmatis-celler med eller uden DNA-skader. Western blotting-analyser blev udført på hele cellelysater ved hjælp af polyklonale antistoffer, der er rejst mod RecA og RecX (Fig. 8C). Kvantificeringen af Western blots viste, at cellerne indeholdt betydelige mængder af både RecA- og RecX-proteiner i uinducerede celler (Fig. 8D,E). Til sammenligning sås en 2-dobbelt stigning i mængden af både RecA og RecX (i forhold til kontrol) i cellerne 3 timer efter eksponering for UV-stråling og faldt herefter. Det er vigtigt, at induktionen af RecA- og RecX-proteiner udviste et mønster, der mindede om det, der blev set i celler under hypoxiske forhold (Fig. 2), selv om de mekanismer, hvormed de beskadiger DNA, sandsynligvis er forskellige.
Slutbemærkninger
Numre undersøgelser har vist, at recA og recX udfører en bred vifte af funktioner i forbindelse med DNA-reparation og rekombination7,10. Så vidt vi ved, er de stimuli, der aktiverer ekspressionen af M. smegmatis recA- og recX-generne, ikke blevet identificeret. I denne undersøgelse blev ekspressionsniveauet for disse gener vurderet i celler ved aerob vækst og som reaktion på forskellige stressbetingelser. I M. smegmatis tilhører recA og recX i lighed med mange bakteriearter det samme operon, og recX-genet er placeret umiddelbart nedstrøms for recA-genet og deler overlappende kodningsregioner86. Det blev konstateret, at DNA-skadende stoffer inducerede ekspressionen af begge gener i forskelligt omfang; ekspressionsforholdene følger dog et lignende mønster. Interessant nok forbliver niveauerne af både RecA og RecX høje under stressbetingelser sammenlignet med aerobe vækstbetingelser.
Flere undersøgelser har påvist alternative roller for recX i den rekombinationelle DNA-reparation, der fremmes af RecA. Mens RecX-proteinet interagerer fysisk med RecA og fungerer som en potent hæmmer af alle kendte funktioner af sidstnævnte i mange bakteriearter14,46,48, potenserer det homolog rekombination i N. gonorrhoeae og B. subtilis25,26. For at få indsigt i recX’s rolle i stressrespons i mykobakterier blev der konstrueret knockout-mutanter af M. smegmatis recX og recArecX. Interessant nok resulterede deletion af recX i M. smegmatis i en lidt mere resistent fænotype over for alle fire DNA-skadelige stoffer, hvilket indikerer en mulig gevinst af funktion som følge af tab af recX-genet. Det molekylære grundlag for denne effekt er ikke klart, og det er værd at udforske i fremtidige undersøgelser. Selv om vores analyse hovedsagelig fokuserede på den genetiske interaktion mellem recA og recX i den rekombinationelle DNA-reparationsvej, synes recX interessant nok at spille en vigtig rolle i bakterievæksten. Sammenfattende er disse resultater i overensstemmelse med tanken om, at M. smegmatis recX spiller en vigtig rolle i DNA-reparation/rekombinationsprocesser under ugunstige forhold, måske ved at regulere de skadelige virkninger af en delmængde af de endnu ukendte gener.
De anvendte forkortelser er
DTT, dithiothreitol; EDTA, ethylendiamin-tetraeddikesyre; kb, kilobase; MMS, methylmethansulfonat; ODN, oligonukleotid; PAGE, polyakrylamidgelelektroforese; PVDF, polyvinylidendifluoridmembran; RT-qPCR, kvantitativ polymerasekædereaktion med omvendt transkription; SDS, natriumdodecylsulfat; ssDNA, enkeltstrenget DNA; SSC, 0.15 M NaCl-0,015 M natriumcitrat (pH 7,0) buffer.