Praksis for humangenetik i Wien

Genombredde søgning efter mikroaberrationer: Array-CGH

Komplekse syndromer, der er baseret på multiplikation eller reduktion af kromosomalt materiale, har længe været kendt. Ved trisomi 21 er der f.eks. et komplet kromosom tre gange i stedet for to gange. Ved mikrodeletionssyndromer som Williams-Beuren-, Prader-Willi- eller Smith-Magenis-syndromet mangler der mere eller mindre definerede dele af et kromosom, som regel på en submikroskopisk skala på nogle få megabaser. I tilfælde af monogenetiske sygdomme er deletioner eller duplikationer af individuelle gener eller gensegmenter for nylig blevet opdaget med stigende hyppighed som årsag til sygdommen.

De teknikker, der hidtil er blevet anvendt til diagnosticering af sådanne ændringer i gendoseringen, har deres begrænsninger: Selv om molekylærcytogenetiske metoder såsom FISH eller molekylærgenetiske metoder såsom MLPA kan anvendes med høj eller højeste opløsning, skal de f.eks. på forhånd vide eller antage, hvilket område af genomet der er påvirket. På den anden side er den klassiske cytogenetik eller CGH-teknikken (“sammenlignende genomisk hybridisering”: Sammenlignende hybridisering af patient- og reference-DNA på metafase-kromosomer) kan dække hele genomet, men opløsningen er i bedste fald begrænset til ca. 5 Mb på grund af brugen af lysmikroskopet.

For at overvinde disse begrænsninger i de eksisterende teknikker er array-CGH et passende alternativ.

Her kombineres den konventionelle CGH-teknik med erfaringerne fra ekspressionsanalyse ved hjælp af mikroarrays: Definerede DNA-fragmenter, der er immobiliseret på overfladen af et glasobjekt, tjener som hybridiseringsmål, hvor udtrykket “array” henviser til den regelmæssige, gitterlignende placering af disse fragmenter. Fragmenterne er udvalgt til at dække det menneskelige genom så jævnt som muligt.

Til analyse samhybridiseres omtrent lige store mængder patient-DNA og et referencegenomisk DNA på arrayet. Da patient- og reference-DNA-prøverne er mærket med forskellige fluorescerende farvestoffer, fører en numerisk ændring i patientens genom til et farveskift i det fluorescerende signal for de enkelte fragmenter via et skift i hybridiseringsforholdet.

Skematisk fremstilling af array-CGH-teknikken:

i scanneren registrerer de fluorescerende signaler og registrerer farveskiftene. Med den relevante software tilknyttes signalerne til genregionen, og til sidst kan resultatet vises, f.eks. som et “karyogram”, der viser, hvor på et kromosom der er ændringer.

Visning af et resultat af array-CGH: duplikation af regionen Xp11-p21.1 (oprettet på ZMG med CGHAnalytics, Agilent)

Antal og tæthed af fragmenter på arrayet bestemmer opløsningen af array-CGH’en. Der findes i øjeblikket arrays med dækning af hele det menneskelige genom med opløsninger fra 1 Mb ned til ca. 35 kb. På grund af det stadigt stigende antal fragmenter pr. array vil opløsningen fortsat stige. Dermed kan ubalancer i individuelle gener påvises pålideligt.

Anvendelser af array CGH

Array CGH er således en teknik, hvor en patients komplette genom kan screenes med høj opløsning for afvigelser fra normal gendosering. Det bliver stadig vigtigere som en innovativ screeningsmetode, selv om det først primært blev anvendt til tumordiagnostik. Dette skyldes, at tumorprogression er karakteriseret ved en ophobning af aberrationer, der kan være ledsaget af amplifikation af onkogener og deletion af tumorsuppressorgener.

ArrayCGH er af særlig interesse for diagnosticering af tilfælde af uforklarlig mental retardering. Ved standardcytogenetik er aberrationer synlige i ca. 5 % af tilfældene hos patienter med mental retardering og yderligere tegn på dysmorfi eller familiær gruppering. Subtelomerscreening med FISH eller MLPA kan finde en årsag i yderligere 5 % af tilfældene. Nyere undersøgelser viser, at array-CGH med en opløsning på ca. 1 Mb afslører genomiske ubalancer hos 10-15 % af patienterne med en diskret karyotype og negative subtelomerfund. (se litteratur). Det antages, at denne detektionsrate vil stige i takt med, at opløsningen af arrays øges. Nogle forskningsgrupper anbefaler allerede array CH som det første diagnostiske skridt i tilfælde af uforklarlig mental retardering.

Men array CH afslører ikke kun nye ubalancer, men kan også bruges til præcist at bestemme størrelsen af deletionen, placeringen af brudpunkterne eller oprindelsen af det ekstra materiale i tilfælde af cytogenetisk synligt tab eller gevinst af kromosomale regioner. Dette er vigtigt for en nøjagtig genotype-fænotype korrelation og for at identificere kandidatgener, der er involveret i udviklingen af MR og dysmorfi. I nogle kromosomale abnormiteter, der tidligere har vist sig at være “afbalancerede” translokationer, har array-CGH været i stand til at påvise, at genetisk materiale er slettet eller duplikeret i området omkring brudpunkterne, og at der således er tale om en ubalanceret translokation. Ved hjælp af array CGH bliver de cytogenetiske resultater således mere præcise og korrigerede.

Så selv om grænserne mellem cytogenetik og molekylærgenetik bliver mere og mere udviskede, er karyotypebestemmelse fortsat vigtig, fordi visse kromosomale ændringer ikke kan påvises med array CGH: Polyploidier, ægte balancerede translokationer og mosaiktilstande med en lille andel af afvigende celler.

På grund af den høje detektionsrate over hele genomet og det faktum, at der ikke er behov for tids- og arbejdskrævende cellekultur, åbner array-CGH nye muligheder for prænatal diagnostik.

Men med alle fordelene og mulighederne ved denne banebrydende teknik bør man ikke glemme, at springet fra forskning til diagnostik her kun lige er begyndt. Array CGH afklarer således ikke kun åbne spørgsmål, men fortolkningen af resultaterne kan også rejse nye spørgsmål:

Gennem array CGH-undersøgelser er det blevet opdaget, at det menneskelige genom indeholder en uventet stor andel af regioner, hvis kopiantal varierer hos fænotypisk normale mennesker (se litteratur). Størrelsen af disse CNV’er (“copy number variations”) varierer fra et par kilobaser til flere megabaser. Det anslås, at hvert individ bærer mindst 3-11 sådanne variationer. Databaser, der opregner sådanne polymorfismer (dvs. mutationer, der ikke tydeligvis påvirker fænotypen), er først lige blevet oprettet og er derfor stadig ufuldstændige. Hvis der nu findes aberrationer i en patients DNA ved hjælp af array-CGH, er det ofte spekulativt, om de overhovedet er ansvarlige for fænotypen. I de fleste tilfælde er det også nødvendigt at undersøge forældrenes DNA.

Sandsynligheden for, at en kromosomal aberration er sygdomsfremkaldende, øges

• med størrelsen af aberrationen
• hvis den er til stede “de novo”, forældrene ikke bærer denne aberration
• hvis den ikke er opført i nogen polymorfismedatabase
• hvis gener er påvirket, som kan forbindes med den observerede fænotype
• hvis tilfælde med samme eller lignende aberration er kendt for at vise en lignende fænotype.

Desto mere array CGH vil blive anvendt i klinisk diagnostik, jo mere sandsynligt er det, at array-designet vil blive tilpasset til kravene på dette område: Ved at undgå kendte CNV-regioner og favorisere kromosomale regioner og gener, der er involveret i mental retardering og dysmorfiske syndromer, vil arrays blive mere og mere interessante for præ- og postnatal diagnostik.

Vores institut har sat kursen for at udnytte array-teknologien nu og for at være i stand til at opfange den fremtidige udvikling med det samme. Vi har valgt teknisk udstyr, der også kan evaluere arrays med den højeste opløsning pålideligt og reproducerbart.

Kontakt os, hvis du ønsker at bruge vores tjenester og erfaring inden for array CGH. Vi vil gerne informere dig om varigheden af en sådan undersøgelse, omkostningerne og de array-designs, der i øjeblikket kan anvendes.

Referencer

Array CGH in mental retardation

Shaw-Smith C, Redon R, Rickman L, Rio M, Willatt L, Fiegler H, Firth H, Sanlaville D, Winter R, Colleaux L, Bobrow M, Carter NP. Mikroarray-baseret komparativ genomisk hybridisering (array-CGH) påviser submikroskopiske kromosomale deletioner og duplikationer hos patienter med indlæringsvanskeligheder/mental retardering og dysmorfiske træk. J Med Genet. 2004 Apr;41(4):241-8.

de Vries BB, Pfundt R, Leisink M, Koolen DA, Vissers LE, Janssen IM, Reijmersdal S, Nillesen WM, Huys EH, Leeuw N, Smeets D, Sistermans EA, Feuth T, van Ravenswaaij-Arts CM, van Kessel AG, Schoenmakers EF, Brunner HG, Veltman JA. Diagnostisk genomprofilering i forbindelse med mental retardering. Am J Hum Genet. 2005 Oct;77(4):606-16.

Menten B, Maas N, Thienpont B, Buysse K, Vandesompele J, Melotte C, de Ravel T, Van Vooren S, Balikova I, Backx L, Janssens S, De Paepe A, De Moor B, Moreau Y, Marynen P, Fryns JP, Mortier G, Devriendt K, Speleman F, Vermeesch JR. Nye mønstre af kryptiske kromosomale ubalancer hos patienter med idiopatisk mental retardering og multiple medfødte anomalier: en ny serie på 140 patienter og en gennemgang af litteraturen. J Med Genet. 2006.

Array-CGH in der Pränataldiagnostik

Rickman L, Fiegler H, Shaw-Smith C, Nash R, Cirigliano V, Voglino G, Ng BL, Scott C, Whittaker J, Adinolfi M, Carter NP, Bobrow M. Prænatal påvisning af ubalancerede kromosomale rearrangementer ved hjælp af array-CGH. J Med Genet. 2006 Apr;43(4):353-61.

Van den Veyver, IB; Beaudet AL. Komparativ genomisk hybridisering og prænatal diagnose. Curr Opin Obstet Gynecol 2006 (18): 185-191.

Die Bedeutung der CNVs (copy number variations) für die Array-CGH

Feuk L, Carson AR, Scherer SW. Strukturel variation i det menneskelige genom. Nat Rev Genet. 2006 Feb;7(2):85-97