Vigtigheden af fiksering
For at kunne studere væv med et mikroskop skal de konserveres (fikseres) og skæres i snit, der er tynde nok til at være gennemsigtige. Fiksering er et kritisk trin i forberedelsen af histologiske snit. Hvis den ikke udføres under optimale forhold, eller hvis fiksering forsinkes, kan en vævsprøve blive uopretteligt beskadiget. Uanset hvor omhyggelig man efterfølgende er med vævsbehandling, mikrotomi og farvning, vil de morfologiske og histokemiske oplysninger, der kan opnås fra prøven, være kompromitteret.
Det overordnede mål med vævsfiksering er at bevare celler og vævskomponenter i en “livagtig tilstand” eller så lidt ændring som muligt af det levende væv og at gøre dette på en sådan måde, at det er muligt at fremstille tynde, farvede snit. Valget af fiksationsmiddel og fikseringsprotokol kan afhænge af de yderligere behandlingstrin og de endelige analyser, der er planlagt. Der findes ikke noget perfekt fiksationsmiddel, selv om formaldehyd kommer tættest på. Derfor kan der anvendes en række forskellige fiksationsmidler, afhængigt af hvilken type væv der er til stede, og hvilke egenskaber der skal påvises.
Fiksationstype
Fiksering af væv kan opnås ved hjælp af kemiske eller fysiske metoder.
Fysiske metoder omfatter opvarmning, mikrobølgebehandling og kryokonservering (frysetørring).
Kemisk fiksering opnås normalt ved at nedsænke prøven i fikseringsmidlet (nedsænkningsfiksering) eller, når det drejer sig om små dyr eller visse hele organer som f.eks. en lunge, ved at perfuse karsystemet med fikseringsmiddel (perfusionsfiksering). Til visse specialiserede histokemiske procedurer er der lejlighedsvis blevet anvendt fiksatorer i dampform. F.eks. kan paraformaldehyd og osmiumtetroxid anvendes til dampfiksering af frysetørret væv.
- Lær mere om Populære fixeringsmidler
Fikseringens mekanisme
De to vigtigste mekanismer for kemisk fiksering er tværbinding og koagulering.
Tværbinding indebærer dannelse af kovalente bindinger både inden for proteiner og mellem dem, hvilket får vævet til at stivne og dermed modstå nedbrydning.
Koagulering skyldes dehydrering af proteiner ved brug af alkoholer eller acetone. Disse reagenser fjerner og erstatter frit vand i celler og væv og forårsager en ændring i proteiners tertiære struktur ved at destabilisere hydrofobiske bindinger. Det kaldes også denaturering.
Faktorer, der påvirker fiksering
- Temperatur: Generelt øgede en temperaturstigning fikseringshastigheden, men øgede også autolysehastigheden og diffusionen af celleelementer. Traditionelt er 0 til 4 °C blevet anset for at være den ideelle temperatur til fiksering af prøverne. Nu udføres fiksering rutinemæssigt ved stuetemperatur.
- Størrelse: 1-4 mm tykkelse
- Volumeforhold: Mindst 15-20 gange større end vævsvolumen
- Tid: 24 – 48 timer
- pH: Bør holdes inden for det fysiologiske område, mellem pH 4-9. pH-værdien for bevarelse af ultrastruktur bør være bufferet mellem 7,2 og 7,4.
Protokoller
- Metoder og protokoller til afkalkning af knoglemateriale
- Standardprotokol for formalinfikseret paraffinindlejret væv
Nyttige links
- Fikseringsprocessen og den Fixeringsmidlers art
- Populære fixeringsmidler
- Grundlæggende introduktion til histologi
- National Society for Histotechnology
- En introduktion til afkalkning
- En praktisk vejledning til god histologisk praksis