- Welche Wahl für Mikrobiomstudien
- Was ist 16S rRNA-Gen-Sequenzierung?
- Was ist Shotgun Metagenomic Sequencing?
- 16S/ITS-Sequenzierung vs. Shotgun-Metagenom-Sequenzierung
- Taxonomieauflösung
- Funktionsprofilierung
- Mikrobielle Abdeckung und empfohlener Probentyp
- Falschpositive
- Störungen durch Wirts-DNA
- DNA-Input
- Here to Help
- Finden Sie heraus, welche Sequenziermethode für Sie am besten geeignet ist. Sprechen Sie mit den Experten der ZymoBIOMICS Sequencing Services.
Welche Wahl für Mikrobiomstudien
16S-Sequenzierung oder Shotgun-Sequenzierung? Fast alle Mikrobiom-Forscher stellen sich diese Frage, wenn sie eine neue Studie planen, denn die überwiegende Mehrheit der Mikrobiom-Publikationen verwendet entweder die 16S rRNA-Gen-Sequenzierung oder die Shotgun-Metagenom-Sequenzierung, um Rohdaten für die anschließende mikrobielle Profilerstellung oder Metagenomik-Analysen zu erzeugen. Jede Methode hat ihre Vor- und Nachteile. Für welche Methode sollten Sie sich also entscheiden?
Was ist 16S rRNA-Gen-Sequenzierung?
Bei der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung, oder einfach 16S-Sequenzierung, werden Teile der hypervariablen Regionen (V1-V9) des bakteriellen 16S rRNA-Gens1 mittels PCR gezielt amplifiziert. Amplikons aus separaten Proben werden dann mit molekularen Barcodes versehen, zusammengeführt und sequenziert. Nach der Sequenzierung werden die Rohdaten mit einer Bioinformatik-Pipeline analysiert, die Trimming, Fehlerkorrektur und den Vergleich mit einer 16S-Referenzdatenbank umfasst. Nachdem die Reads einem phylogenetischen Rang zugeordnet wurden, kann ein taxonomisches Profil erstellt werden. Die ITS-Sequenzierung folgt der gleichen Strategie, zielt aber auf die ITS-Region (Internal transcribed spacer) in Pilzgenomen ab.
Was ist Shotgun Metagenomic Sequencing?
Im Gegensatz zur 16S-Sequenzierung, die nur auf 16S rRNA-Gene abzielt, wird bei der Shotgun Metagenomic Sequencing die gesamte genomische DNA einer Probe sequenziert. Der Arbeitsablauf für die Bibliotheksvorbereitung ist ähnlich wie bei der regulären Ganzgenomsequenzierung, einschließlich zufälliger Fragmentierung und Adapterligation. Ein typischer Arbeitsablauf für die taxonomische Analyse von Shotgun-Metagenomdaten umfasst das Qualitätstrimming und den Vergleich mit einer Referenzdatenbank, die ganze Genome (z. B. Kraken2 und Centrifuge3) oder ausgewählte Markergene (MetaPhlAn4 und mOTU5) umfasst, um ein taxonomisches Profil zu erstellen. Da die Shotgun-Metagenom-Sequenzierung alle genetischen Informationen in einer Probe erfasst, können die Daten für zusätzliche Analysen verwendet werden, z. B. für die metagenomische Assemblierung und das Binning, die Erstellung von Stoffwechsel-Funktionsprofilen und die Erstellung von Antibiotikaresistenz-Genprofilen.
16S/ITS-Sequenzierung vs. Shotgun-Metagenom-Sequenzierung
Wenn Ihre Studie genomische Analysen erfordert, die über die Erstellung von Taxonomieprofilen hinausgehen, wie z. B. die Analyse von Stoffwechselwegen, sollten Sie die Shotgun-Metagenom-Sequenzierung aufgrund ihrer größeren genomischen Abdeckung und Datenausgabe in Betracht ziehen. Wenn die Erstellung von Zusammensetzungsprofilen der Hauptzweck der Studie ist, haben beide Techniken Vor- und Nachteile, die berücksichtigt werden müssen (Tabelle 1).
Taxonomieauflösung
Die Taxonomieauflösung der 16S/ITS-Sequenzierung hängt von den anvisierten variablen Regionen, dem Organismus selbst und dem Sequenzanalysealgorithmus ab. In den letzten Jahren haben einige Fehlerkorrekturmethoden, z. B. DADA26, die Genauigkeit und die taxonomische Auflösung dieser Technik drastisch verbessert. Mit DADA2 ist die Auflösung auf Artniveau für viele Organismen mit normaler 16S-Sequenzierung nun Realität. Theoretisch kann die Shotgun-Metagenomsequenzierung jedoch eine Auflösung auf Stammebene erreichen, da sie alle genetischen Variationen erfassen kann. In der Praxis steht die Genauigkeit der Auflösung auf Stammebene jedoch noch vor technischen Herausforderungen. Dennoch erreicht die Shotgun-Metagenomsequenzierung eine höhere Auflösung als die 16S/ITS-Sequenzierung.
Funktionsprofilierung
Wenn die Analyse der Stoffwechselfunktion ein Ziel ist, werden die meisten Forscher die 16S- und ITS-Sequenzierung schnell übersehen. Es gibt jedoch einige Tools, mit denen sich aus Taxonomiedaten auf die Stoffwechselfunktion schließen lässt, z. B. PICRUSt7. Im Allgemeinen wird die metagenomische Shotgun-Sequenzierung jedoch häufig eingesetzt, wenn eine funktionelle Profilierung erforderlich ist, da sie zusätzliche Gene abdeckt.
Mikrobielle Abdeckung und empfohlener Probentyp
Bei der Shotgun-Sequenzierung wird die gesamte metagenomische DNA untersucht, während bei der 16S-Sequenzierung nur die 16S-rRNA-Gene untersucht werden, die ebenfalls unter einer unvollständigen Primerabdeckung leiden. Folglich hat die erstgenannte Methode eine größere domänenübergreifende Abdeckung. Warum wird dann in Tabelle 1 die 16S/ITS-Sequenzierung als besser für die Abdeckung von Bakterien und Pilzen eingestuft? Dies ist auf die Artenabdeckung der verfügbaren Referenzdatenbanken zurückzuführen, da die taxonomische Vorhersage dieser Sequenzierungsverfahren stark von der verwendeten Referenzdatenbank abhängt. Derzeit ist die Abdeckung von 16S/ITS-Datenbanken viel besser als die von Ganzgenom-Datenbanken. Dies liegt daran, dass die gesamten Genome von Mikroben, die mit dem menschlichen Mikrobiom assoziiert sind, viel besser untersucht sind als Genome von Mikroben, die mit anderen Umgebungen assoziiert sind. Aus diesem Grund wird empfohlen, die Shotgun-Metagenom-Sequenzierung für Proben, die mit dem menschlichen Mikrobiom in Verbindung stehen, wie z. B. Fäkalien und Speichel, zu verwenden, wenn die Erstellung von Taxonomieprofilen der Hauptzweck ist.
Außerdem ist die Metagenom-Sequenzierung stärker von der Referenzdatenbank abhängig. Wenn zum Beispiel ein Bakterium keinen eng verwandten Vertreter in der 16S-Referenzdatenbank hat, kann man es vielleicht in einem höheren phylogenetischen Rang oder als unbekanntes Bakterium identifizieren. Wenn jedoch bei der Shotgun-Metagenom-Sequenzierung ein Bakterium keinen nahen Verwandten (ein Genom der gleichen Gattung) in der Referenzgenom-Datenbank hat, wird es wahrscheinlich völlig übersehen. Die ZymoBIOMICS Spike-in Control I enthält beispielsweise zwei dem menschlichen Mikrobiom fremde Mikroben (Imtechella halotolerans und Allobacillus halotolerans), deren Genome bisher nicht verfügbar waren. Wenn man sie in eine fäkale Probe einbringt und mit Shotgun-Sequenzierung sequenziert, werden sie in den meisten bioinformatischen Pipelines völlig übersehen, es sei denn, man fügt diese beiden Genome manuell in die Referenzdatenbank ein. Werden sie hingegen mit 16S-Sequenzierung analysiert, werden sie aufgrund des Vorhandenseins ihrer 16S-Sequenz in Referenzdatenbanken identifiziert.
Falschpositive
Fehlerkorrektur-Tools wie DADA2 verbessern nicht nur die taxonomische Auflösung der 16S/ITS-Sequenzierung, sondern auch die Genauigkeit. Dies zeigt sich bei der Sequenzierung von DNA aus der mikrobiellen Scheingemeinschaft (z. B. ZymoBIOMICS Microbial Community Standard). Alle 16S-Sequenzen werden ohne Fehler in der Sequenz wiedergefunden, d. h. es gibt keine falsch positiven Ergebnisse. Bei der Shotgun-Metagenomsequenzierung ist es jedoch wahrscheinlich, dass die bioinformatische Analyse das Vorhandensein mehrerer „eng verwandter“ Genome vorhersagt, es sei denn, es gibt ein perfektes repräsentatives Genom in der Referenzdatenbank für eine sequenzierte Mikrobe. Diese eng verwandten Genome können von verschiedenen Arten der gleichen Gattung oder sogar von verschiedenen Gattungen stammen. Nehmen wir zum Beispiel an, dass es drei eng verwandte Mikroben gibt, A, B und C, und dass sie einige Sequenzen gemeinsam haben. Wenn die Referenzdatenbank nur Genome von B und C enthält, wird die Bioinformatik bei der Sequenzierung von A vorhersagen, dass sowohl B als auch C vorhanden sind. Zum Beispiel könnten sowohl A als auch B Stämme von Escherichia coli sein und C ist Salmonella enterica; die Sequenzen, die B und C eindeutig gemeinsam haben, könnten von einem horizontalen Gentransfer stammen, der zwischen eng verwandten Mikroben üblich ist. Aus diesem Grund ist die 16S/ITS-Sequenzierung im Hinblick auf falsch-positive Ergebnisse besser geeignet.
Störungen durch Wirts-DNA
Das Vorhandensein von zu viel Wirts-DNA kann bei der Bibliotheksvorbereitung für die 16S- und ITS-Sequenzierung zu unspezifischen Amplifikationen führen, aber die Auswirkungen lassen sich durch Anpassung der PCR-Zyklen und Wechsel der Primer kontrollieren. Andererseits ist die Beeinträchtigung durch Wirts-DNA ein viel schwierigeres Problem bei der Shotgun-Metagenom-Sequenzierung, auch wenn die Kosten für die Sequenzierung drastisch gesunken sind. Je nach Art der Probe können einige Proben >99 % menschliche Wirts-DNA enthalten, was nicht nur die Sequenzierungskosten erhöht, sondern auch zu Unsicherheiten bei den Messungen führt. Aus diesem Grund beschäftigen sich viele Forscher mit der Abreicherung der Wirts-DNA, z. B. mit dem HostZERO Microbial DNA Kit, vor der Bibliotheksvorbereitung für die Shotgun-Sequenzierung. Es kann jedoch sein, dass nach der Wirts-DNA-Abreicherung nicht mehr genügend mikrobielle genomische DNA für die Shotgun-Sequenzierung übrig bleibt, die normalerweise eine Mindestmenge von 1ng erfordert. Die Interferenz der Wirts-DNA ist der Grund, warum die flache Shotgun-Sequenzierung nur für menschliche Fäkalproben empfohlen wird.
DNA-Input
Während die metagenomische Shotgun-Sequenzierung mindestens 1 ng DNA-Input erfordert, ist die 16S/ITS-Sequenzierung viel empfindlicher, wobei das Input-Minimum bei Femtogrammen oder sogar bei nur 10 Kopien von 16S rRNA-Genen liegt.
Here to Help
Die Wahl zwischen 16S-Sequenzierung und Shotgun-Metagenom-Sequenzierung ist ein entscheidender Schritt für alle Mikrobiomstudien. Neben dem Budget müssen viele Aspekte des Projekts berücksichtigt werden, darunter der Probentyp, die gewünschten Analysen, die Auflösung der Taxonomie und die Zielorganismen. Die Berücksichtigung dieser Überlegungen wird Ihnen helfen, die richtige Sequenzierungsmethode für Ihr nächstes Mikrobiomprojekt zu wählen. Die Mikrobiom-Sequenzierungsdienste von ZymoBIOMICS bieten 16S-, ITS- und Shotgun-Sequenzierung als komplette Dienstleistungen von der DNA-Extraktion bis zur Sequenzierung und Bioinformatik. Die Sequenzier- und Bioinformatik-Experten von Zymo Research helfen Ihnen gerne bei der Auswahl der richtigen Sequenziermethode für Ihre Studie.
Finden Sie heraus, welche Sequenziermethode für Sie am besten geeignet ist. Sprechen Sie mit den Experten der ZymoBIOMICS Sequencing Services.
Erfahren Sie mehr
1. Laudadio I, Fulci V, Stronati L, Carissimi C. Next-Generation Metagenomics: Methodological Challenges and Opportunities. Omics a Journal of Integrative Biology 2019 23(7): 327-333.
2. Wood DE, Salzberg SL. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology 2014 15(3): R46.
3. Kim D, Song L, Breitwieser FP, Salzberg SL. Centrifuge: schnelle und sensitive Klassifizierung von metagenomischen Sequenzen. Genome Research 2016 26(12): 1721-1729.
4. Segata N, Waldron L, Ballarini A, Narasimhan V, Jousson O, Huttenhower C. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods 2012 9(8): 811-814.
5. Sunagawa S, et al. Metagenomic species profiling using universal phylogenetic marker genes. Nature Methods 2013 10(12): 1196-1199.
6. Callahan BJ, McMurdie PJ, Rosen MJ, Han AW, Johnson AJA, Holmes SP. DADA2: High resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods 2016 13(7): 581-583.
7. Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, Reyes JA, Clemente JC, Burkepile DE, Vega Thurber RL, Knight R, Beiko RG, Huttenhower C. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology 2013 31(9): 814-821.
November 13, 2019