Zählung lebensfähiger Zellen
Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten, die Anzahl der Bakterien in einer Probe zu bestimmen. Eine Zählung der lebensfähigen Zellen ermöglicht es, die Anzahl der aktiv wachsenden/teilenden Zellen in einer Probe zu ermitteln. Die Methode der Plattenzählung oder Ausbreitungsplatte beruht auf Bakterien, die auf einem Nährmedium eine Kolonie bilden. Die Kolonie wird mit dem bloßen Auge sichtbar, und die Anzahl der Kolonien auf einer Platte kann gezählt werden. Um effektiv zu sein, muss die Verdünnung der ursprünglichen Probe so gestaltet sein, dass im Durchschnitt zwischen 30 und 300 Kolonien des Zielbakteriums wachsen. Bei weniger als 30 Kolonien ist die Auswertung statistisch unsicher, bei mehr als 300 Kolonien kommt es häufig zu Überschneidungen und Ungenauigkeiten bei der Zählung. Um sicherzustellen, dass eine angemessene Anzahl von Kolonien gebildet wird, werden normalerweise mehrere Verdünnungen gezüchtet. Das Laborverfahren umfasst die Herstellung serieller Verdünnungen der Probe (1:10, 1:100, 1:1000 usw.) in sterilem Wasser und die Kultivierung dieser Verdünnungen auf Nährstoffagar in einer verschlossenen und bebrüteten Schale. Typische Nährböden sind z. B. Plate count agar für eine allgemeine Zählung oder MacConkey agar für die Zählung gramnegativer Bakterien wie E. coli. Üblicherweise wird ein Satz Platten 24 Stunden lang bei 22 °C bebrütet und ein zweiter Satz 24 Stunden lang bei 37 °C. Die Zusammensetzung des Nährmediums enthält in der Regel Reagenzien, die das Wachstum von Nicht-Zielorganismen verhindern und den Zielorganismus leicht erkennbar machen, oft durch einen Farbwechsel des Mediums. Einige neuere Methoden enthalten einen Fluoreszenzstoff, so dass die Zählung der Kolonien automatisiert werden kann. Am Ende der Inkubationszeit werden die Kolonien mit dem Auge gezählt, ein Verfahren, das nur wenige Augenblicke in Anspruch nimmt und kein Mikroskop erfordert, da die Kolonien in der Regel nur wenige Millimeter groß sind.
Die Pour-Plate-Methode wird angewandt, wenn die Analyse auf Bakterienarten abzielt, die in Luft schlecht wachsen. Bei der ersten Analyse werden serielle Verdünnungen der Probe in flüssigem Nährboden gemischt, der dann in Flaschen gegossen wird. Die Flaschen werden dann verschlossen und auf die Seite gelegt, so dass eine schräge Agaroberfläche entsteht. Die Kolonien, die sich auf dem Nährboden entwickeln, können nach der Bebrütung mit dem Auge gezählt werden. Die Gesamtzahl der Kolonien wird als Total Viable Count (TVC) bezeichnet. Die Maßeinheit ist cfu/ml (oder koloniebildende Einheiten pro Milliliter) und bezieht sich auf die Originalprobe. Die Berechnung ist ein Vielfaches der gezählten Kolonienzahl, multipliziert mit der verwendeten Verdünnung. Beispiele für eine Zählung lebensfähiger Zellen sind Ausstrichplatten aus einer seriellen Verdünnung einer Flüssigkultur und Gießplatten. Mit einer Ausstrichplatte werden serielle Verdünnungen in flüssigen Medien vorgenommen und dann ein bekanntes Volumen aus dem letzten Röhrchen der Verdünnungsreihe ausgestrichen. Die Kolonien auf der Platte können dann gezählt und die Konzentration der Bakterien in der ursprünglichen Kultur kann berechnet werden. Bei der Pour-Plate-Methode wird eine verdünnte bakterielle Probe mit geschmolzenem Agar vermischt und diese Mischung dann in eine Petrischale gegossen. Auch hier werden die Kolonien gezählt und die Anzahl der lebensfähigen Zellen berechnet.