Analyse und Beschreibung der Stadien der Biofilmbildung von Aspergillus fumigatus mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie

Aus medizinischer Sicht ist Aspergillus fumigatus ein opportunistischer Erreger von immungeschwächten Personen, dessen Krankheitsschwere vom Immunstatus des Wirts abhängt und der eine Sterblichkeitsrate von 50-95 % aufweist. Dieser Pilz führt zu lokalen Infektionen wie Nageldermatomykosen oder Pilzkeratitis und zu invasiven Infektionen wie Aspergillose und ist die zweithäufigste Ursache von Pilzinfektionen bei Krankenhauspatienten. Eine Infektion der Atemwege mit A. fumigatus kann Lungenpilzball, invasive Aspergillose, invasive pulmonale Aspergillose (IPA), Hypersensitivitätspneumonitis, Asthma, Immunglobulin E-vermittelte allergische Rhinitis, chronische nekrotisierende Pneumonie oder allergische bronchopulmonale Aspergillose (ABPA) verursachen. Darüber hinaus führt er zu Osteomyelitis und Endokarditis.

A. fumigatus entwickelt einen Biofilm, der einer der wichtigsten Virulenzfaktoren sein kann. Der Biofilm von A. fumigatus bildet in vitro Myzelien, die in ein EMC eingebettet sind, und die Biofilmbildung wurde in menschlichen Bronchialepithelzellen (HBE) und zystischen Fibrose-Bronchialepithelzellen (CFBEC) sowie bei Patienten mit zystischer Fibrose beschrieben. Die Bildung von Pilzbiofilmen auf Kathetern und Prothesen trägt zur Entstehung von nosokomialen Infektionen bei. Die Persistenz von Pilzinfektionen ist also auf die Fähigkeit eines Pilzes zurückzuführen, Biofilme auf einer Vielzahl von Medizinprodukten zu bilden, und darauf, dass die persistierenden Zellen einen wichtigen Resistenzmechanismus darstellen. Die Therapie eines etablierten Biofilms im Wirt erfordert in der Regel die Verabreichung toxischer Konzentrationen von antimikrobiellen Mitteln, und die empfohlene Behandlung umfasst die Entfernung des befallenen Geräts; dies ist jedoch ein schwieriger und kostspieliger Prozess. Daher sind Pilzbiofilme ein großes klinisches und wirtschaftliches Problem.

In den letzten zehn Jahren wurden mehrere Studien über den Biofilm von A. fumigatus veröffentlicht, sowohl in vivo (in Mausmodellen, bei Patienten mit invasiver Lungenaspergillose und in primären menschlichen Epithelkulturen) als auch in vitro (auf Polystyrolplatten). Im Allgemeinen befassen sich diese Studien hauptsächlich mit dem Reifestadium des Biofilms und der chemischen Zusammensetzung der ECM, mit wenigen Bildern der Biofilmstadien, aber jede dieser Studien beschreibt alle Stadien der Biofilmbildung. Somit unterscheiden sich die Informationen von den Beiträgen unserer Arbeitsgruppe.

Die wichtigsten Beiträge dieser Studie sind die folgenden: i) wir liefern eine Beschreibung aller Stadien der Biofilmbildung von A. fumigatus in vitro, über die Zeit, und die Stadien werden mit REM-Bildern unterstützt; ii) wir haben zwei verschiedene Ursprünge von Isolaten analysiert: eines aus der Umwelt und eines von einem Patienten mit Hornhautgeschwür; iii) wir berichten über Mikro-Hyphen (klinisches Isolat) und Pilzstrukturen, über die bisher kaum berichtet wurde und die unseres Wissens für die Aspergillus-Spezies nicht beschrieben wurden; und iv) wir liefern eine Beschreibung des Dispersionsschritts für die Bildung der Biofilmkolonisation an neuen Punkten.

Um die strukturelle Organisation des reifen Biofilms von A. fumigatus (24 h Inkubation bei 28 °C und 37 °C) zu analysieren, wurden zwei Stämme, einer aus dem Boden und ein anderer von einem Patienten mit Pilzkeratitis, mittels REM untersucht. Ein Überblick über die in dieser Untersuchung beobachtete Biofilmbildung von A. fumigatus ergab, dass sich diese Biofilme ähnlich verhielten, unabhängig davon, ob das Isolat aus dem Boden oder aus der Klinik stammte; es gab jedoch Unterschiede je nach Inkubationstemperatur. Bei 28 °C zeigte der Biofilm ähnliche Stadien wie beim klassischen mikrobiellen Wachstum: die verzögerte, die exponentielle und die stationäre Phase; das Biofilmwachstum war langsam und stabil mit einer geringen ECM-Produktion, und die strukturelle Organisation des Pilzes war einfach (Abb. 1). Bei 37 °C zeigte die Leistungskurve eine recht variable lag- (Anpassungs-) und log- (Exponential-) Phase, was eine Reaktion auf Stress aufgrund der Inkubation bei hoher Temperatur sein könnte; so gibt es bei 37 °C eine Verringerung der Anpassungsphase (lag), um den lebensfähigen Pilz zu erhalten; auch die log-Phase mit einem diskontinuierlichen Anstieg und mit beiden Verhaltensweisen ist wahrscheinlich eine adaptive Reaktion. So gab es bei 37 °C während der Reifungsphase extrem organisierte Myzelstrukturen, und diese waren reduziert und verdichtet mit Hyphen, die verdickt und zu Anastomosen verschmolzen waren, und die ECM war reichlich vorhanden, um die Pilzstrukturen zu bedecken, zu umgeben und zu stärken (Abb. 3 und 4). 3 und 4).

In dieser Studie haben wir die Biofilmstadien von A. fumigatus mittels REM nachgewiesen. Die während der Biofilmbildung beobachteten Stadien waren wie folgt:

Anhaftung, Zellkoaggregation und EPS-Produktion

In einem frühen Stadium (Abb. 2/4 h) haften die Konidien an der Plattenoberfläche durch eine Interaktion elektrostatischer Kräfte zwischen den strukturellen Komponenten der Pilzzellwand, und diese Anziehungskraft ist schwach und daher reversibel. Die irreversible und dauerhafte Bindung ist weitgehend in spezifischen bakteriellen Adhäsinen beschrieben worden, die auf der Zelloberfläche vorhanden sind und sich an das Substrat und EPS binden. EPS sind Substanzen, die vom Mikroorganismus in den Anfangsstadien der Biofilmbildung produziert werden und die für die Adhäsion der Zellen untereinander und an das Substrat sorgen und aus Protein-Kohlenhydrat-Komplexen und Glykoproteinen bestehen, die hauptsächlich strukturelle oder adhäsive Funktionen erfüllen. Adhäsine sind an der Erkennung von Bakterienzellen untereinander beteiligt, einschließlich der Bildung von Brücken und der Initiierung der Koloniebildung. Adhäsine sind bei der Adhäsion von Pilzen während der Biofilmbildung beschrieben. In Biofilmen von Candida albicans, Candida glabrata und Candida tropicalis gibt es eine Gruppe von Adhäsionsgenen, die an der Biofilmbildung beteiligt sind und zur Familie der agglutininähnlichen Sequenzen (ALS) gehören, die bei diesem Prozess eine Schlüsselrolle spielen und für Proteine kodieren, die die Eigenschaften von Adhäsin-Glykoproteinen auf der Zelloberfläche besitzen. Die ALS-Familie in C. albicans besteht aus acht Genen (ALS1-ALS7 und ALS9), die für zahlreiche Oberflächenglykoproteine kodieren. Bei A. fumigatus wurden sechs Hydrophobine, bestehend aus den Stäbchen RodAp, RodBp, RodCp, RodDp, RodEp und RodFp, auf der Oberfläche der Konidien identifiziert. Diese hydrophobe Eigenschaft ermöglicht die Adhäsion an Proteine der Wirtszellen, und sie könnten an der Adhäsion an der Oberfläche der Polystyrolplatte beteiligt sein und den Prozess der Biofilmbildung in allen oder nur in zwei oder drei dieser Zellen einleiten. Darüber hinaus beschrieben Gravelat und Mitarbeiter diese Interaktion zwischen den Pilzen und stellten fest, dass das Adhäsin MedA die Adhäsion an der Polystyrolplatte, die Biofilmbildung und die Expression von Konidiationsgenen steuert und dass es harte Auswirkungen auf den Konidiationsprozess bei A. fumigatus hat. Die Adhäsion, die aus der Interaktion zwischen Pilzadhäsinen und der Plattenoberfläche resultiert, und die Adhäsion Konidium-Konidium lösen wahrscheinlich Signalvorgänge aus und fördern die Zellkoaggregation und die EPS-Produktion; diese Ereignisse sind in Abb. 2 (4 h) dargestellt. Gleichzeitig beschleunigt EPS die Bildung von Pilzkolonien durch die enge Bindung der Zellen (Abb. 2 (8-12 h)).

Konidienkeimung zu Hyphen und Entwicklung

Die Biofilmbildung erfordert eine Schwellenzahl von Zellen, damit sie wahrgenommen werden und eine Reaktion hervorrufen können, was ein Regulationsmechanismus der Genexpression mit spezifischen Funktionen ist. Bei der Biofilmbildung von A. fumigatus ist die Konidienoberfläche vor Beginn der Konidienkeimung ausgesprochen hydrophob und besteht zu 40 % aus hydrophoben Methylgruppen. Die Keimung der Konidien von A. fumigatus führt zum Aufbrechen der hydrophoben proteinartigen Stäbchenschicht und bringt die inneren Konidienwände zum Vorschein, die im Wesentlichen aus Polysacchariden bestehen, die hydrophile Zellwandkomponenten sind. An einer einzelnen keimenden Spore befindet sich eine hydrophobe Spitze. Das Konidium verliert allmählich seine Oberflächenhydrophobie, und die neue Wachstumsspitze weist dann eine Koexistenz von hydrophoben Stäbchen und hydrophilen Polysacchariden auf. Die Keimung der Konidien zu Hyphen beginnt mit der Bildung von Keimschläuchen, wie in Abb. 2 dargestellt (8-12 h), die eine sehr hydrophile Zellwand besitzen und das Hyphenwachstum begünstigen.

Biofilmreifung

Die Reifung des Biofilms von A. fumigatus wurde bei 24 h beobachtet, eine Inkubationszeit, die mit der von anderen Forschern berichteten vergleichbar ist. Zu den strukturellen Komponenten gehört die ECM, die im reifen Biofilm vorhanden ist und die Zellen bindet, um die strukturelle Basis des Biofilms zu bilden, einschließlich der EPS und vieler organisierter Myzelien (Abb. 2 (24 h0) . ECM. Wasser ist der am häufigsten vorkommende Bestandteil und macht im Biofilm fast 97 % aus. In dieser feuchten Umgebung befindet sich ein geordnetes makromolekulares Netzwerk. Die wichtigsten Funktionen, die für EPS in bakteriellen Biofilmen beschrieben werden, sind: Adhäsion, Zellaggregation, Kohäsion, Wasserrückhalt, Schutzbarriere als spezifische Wirtsabwehr oder antimikrobielle Mittel, Absorption organischer Verbindungen und anorganischer Ionen, enzymatische Aktivität, Nährstoffquelle, Austausch genetischer Informationen, Elektronendonor oder -akzeptor, Export von Zellbestandteilen, Speicherung überschüssiger Energie und Stabilisierung von Enzymen. In Pilzbiofilmen sind noch nicht alle diese Funktionen beschrieben, aber einige davon werden untersucht: Die Kohäsions- und Adhäsionskräfte der Matrix tragen zur architektonischen und mechanischen Stabilität des Biofilms bei. Die Pilzzellen sind in der Matrix immobilisiert und verhalten sich wie ein funktionierendes Ökosystem, das sich ständig verändert und homöostatisch reguliert, mit intensiven Interaktionen, einschließlich der Zell-Zell-Kommunikation, die als Klebstoff dient, der die Zellen zusammenhält. Die Struktur des Biofilms variiert stark je nach dem Mikroorganismus, der ihn bildet, und den Bedingungen, die seine Mikrohabitate umgeben, einschließlich der strukturellen Unterschiede, die mit dem klinischen Erscheinungsbild verbunden sind. Während der infektiösen Prozesse unterstützt die ECM den Schutz vor dem Wirt sowie die Resistenz der Mikroorganismen gegen Medikamente; die ECM ist also nicht nur ein mechanisches Gerüst, sondern auch ein Regulator des Zellverhaltens. Die hydrophoben Proteine der Matrix sind an die spezifischen Zelloberflächenrezeptoren gebunden, was zu einer Zell-Matrix-Adhäsion führt, die sich auf die Zellform, die Migration, die Proliferation, das Überleben der Zellen und den Stoffwechsel auswirkt. Darüber hinaus schützt die ECM die Zellen vor Umwelteinflüssen wie Austrocknung, UV-Strahlung, Oxidation, Hunger, Fressfeinden, der Immunabwehr des Wirtes und Antibiotika. Die ECM-Merkmale waren in Abb. 2 (24 h) und Abb. 3 deutlich zu erkennen und hafteten an den Pilzhyphen in einer zusammenhängenden Hülle und wurden auch mit einer porösen Konsistenz beobachtet (Abb. 2 (24 h)). Im Biofilm von A. fumigatus war die EPS hochgradig strukturiert und wurde reichlich produziert, um die Pilzstrukturen zu bedecken, zu umgeben und zu verstärken; sie wirkt als Kohäsiv für die Verschmelzung der Hyphen-Hyphen-Strukturen (nur 37 °C). Das EPS hat ein schleimiges Aussehen, das vollständig an den Hyphen haftet und diese bedeckt, wodurch eine Anastomose entsteht und das Lumen der Wasserkanäle verschlossen wird (Abb. 2 (24 h), 3 und 4). In früheren Studien beschrieb unsere Arbeitsgruppe das Reifungsstadium des Biofilms von A. fumigatus, in dem ähnliche Strukturen beobachtet wurden.

Bei einigen Mikrokonsortien ist die chemische Zusammensetzung der EPS bekannt (Kohlenhydratpolymere, DNA und/oder Proteine und Lipide u.a.), andere müssen noch identifiziert werden. Die Oberfläche von A. fumigatus besteht aus α-1,3-Glucanen, Chitin, Chitosan, Galactomannan, Galactosaminogalactan, Melanin und Proteinen. Die Zusammensetzung und die strukturelle Organisation der Zellwand werden ständig umgestaltet; auch wenn die vorhandenen Polysaccharide gleich sind, variieren ihre Menge und ihre Lokalisierung je nach Wachstumsbedingungen und Ernährungsumfeld. Wir haben die chemische Zusammensetzung des Biofilms von A. fumigatus aufgezeigt, die durch die Co-Lokalisierung von Fluorochromen, die an Chitin, Stoffwechselaktivität und Nukleinsäuren gebunden sind, mittels CLSM beobachtet wurde; darüber hinaus wurde die Überlappung der Fluorochromsignale beobachtet, wenn zwei oder drei davon gebunden waren (Abb. 5). Die für Polysaccharide wie α-1,3-Glucane beschriebene Funktion bestand darin, dass sie in vitro eine vorherrschende Rolle bei der Hyphenaggregation und bei der Hyphenaggregation in Biofilmen spielten. Andere Polysaccharide der ECM, darunter Galactomannan und Galactosaminogalactan, spielen ebenfalls eine Rolle beim Schutz des Pilzes und bei der Anhaftung seiner Biofilmstrukturen an Oberflächen. Extrazelluläre DNA (eDNA) ist ein wichtiger Bestandteil des ECM-Biofilms, der die strukturelle und architektonische Integrität von A. fumigatus aufrechterhält. Die eDNA entsteht durch Autolyse und steht in signifikantem Zusammenhang mit dem Grad der Pilzresistenz (Abb. 5). Darüber hinaus kann die eDNA ein Genreservoir für den horizontalen Gentransfer darstellen. DNA verleiht eine solidere und widerstandsfähigere strukturelle Organisation, wenn sie mit Polysacchariden kolokalisiert ist. eDNA wird von Pilzzellen durch die Sekretion von Chitinasen durch A. fumigatus freigesetzt (Abb. 5). Im Biofilm hat die Zellwandmodifikation einen wesentlichen Einfluss auf die Resistenz gegen Zellwandmedikamente. Bei A. fumigatus wurde in einem Maus-Biofilmmodell das Gen der multiresistenten (MDR) Efflux-Pumpe AfuMDR4, das mit dem Ausstoß von antimikrobiellen Substanzen assoziiert ist, durch die Behandlung mit Voriconazol nach 24 Stunden signifikant induziert. Der FUN1-Marker zeigte metabolische Aktivität, die eine lebende Gemeinschaft ist (Abb. 5).

Myzelien: Der Biofilm zeigt eine komplexe dreidimensionale (3-D) Struktur, die einen koordinierten zellulären Prozess widerspiegelt; Myzelentwicklung und -expansion waren offensichtlich, einschließlich verdichteter Hyphenschichtnetzwerke, Hyphen-Hypha-Adhäsion, Anastomose bei beiden Temperaturen, mit optimaler räumlicher Anordnung, die Kanäle bildet, um den Zufluss von Nährstoffen und den Abfluss von Abfallprodukten zu gewährleisten und somit den Biofilm zu stabilisieren; bei 37 °C war dieser Kanal deutlicher (Abb. 2 (24 h), 3 und 4). Darüber hinaus wurden diese Strukturen auch von anderen Forschern beobachtet. Mikrohyphen: In den frühen Stadien der Biofilmreifung wurden im klinischen Isolat unregelmäßige Pilzstrukturen, wie z. B. Mikrohyphen, beobachtet (Abb. 4). Dies ist insofern von Bedeutung, als in der Literatur nur wenige Hinweise auf Mikrohyphen zu finden sind, und es ist das erste Mal, dass sie bei A. fumigatus beschrieben wurden. Mikrohyphen weisen Veränderungen des Zytoskeletts auf, die zu kurzen und schlanken Hyphen mit dünnen Wänden und gebogenen Enden führen. Mikrohyphen sind mit einer hohen enzymatischen Aktivität verbunden, die den Reifungsprozess und die anschließende Zelldispersion im Biofilmstadium begünstigt.

Zelldispersion

Bei der Zelldispersion wird ein Teil des Biofilms abgelöst, der die Konidien oder Hyphen umfasst. Es wurde eine asynchrone Entwicklung des Biofilms beobachtet, insbesondere im Stadium der Biofilmreifung, als die neuen Konidien keimfähig waren und neues Myzelwachstum und Hyphenveränderungen, wie z. B. Locken, hervorriefen (Abb. 4 und 6). Die Zelldispersion des Biofilms erfolgt als Reaktion auf Umweltveränderungen. Dadurch wird eine gefährliche Substanz aus dem Hauptkörper des Biofilms entfernt. Dieser Prozess führt zur Ausbreitung und Vermehrung der im Biofilm verweilenden Zellen an einem neuen Ort, was durch komplexe molekulare Vorgänge unterstützt wird. Biofilme können als schützende Hüllen für die darunter liegenden lebenden Zellen betrachtet werden, die äußerst komplexe und unzählige Funktionen haben und somit wahrhaft bemerkenswerte biologische Konstruktionen darstellen. Biofilme bieten Schutz vor Raubtieren oder chemischen Angriffen und stellen den inneren Zellen ein Medium für die intrazelluläre Kommunikation, den Nährstofffluss und die Übertragung von genetischem Material zur Verfügung. Durch die Zelldispersion werden lebensfähige Zellen an andere Orte in der Umwelt oder innerhalb eines Wirts verbreitet, wo sich die Zellen vermehren können, was ihr Fortbestehen erleichtert. Die Zelldispersion ist eine Folge des Nährstoffmangels in der Umwelt und somit ein Überlebensmechanismus. Daher ist die Zelldispersion nicht nur für die Förderung der genetischen Vielfalt wichtig, sondern auch für die Flucht aus ungünstigen Lebensräumen, die Entwicklung neuer Nischen und die Persistenz des Mikroorganismus an einem neuen Ort.