Antisense-Oligonukleotide für SMN2
ASOs sind einzelsträngige Nukleinsäuren, die so synthetisiert werden, dass sie komplementär zu einer Ziel-RNA-Sequenz sind. Nach der Verabreichung wird die ASO über einen noch unzureichend definierten endozytischen Mechanismus in die Zelle aufgenommen und gelangt dann in den Zellkern, wo sie an ihre Ziel-pre-mRNA bindet.62 Ursprünglich wurden ASOs zur Unterdrückung der Genexpression eingesetzt, indem sie entweder die Translation eines RNA-Ziels blockierten oder dessen Abbau förderten. Heutzutage können ASOs auch so konzipiert werden, dass sie die Verarbeitung oder das Spleißen eines Targets verändern. Therapeutische ASOs für SMA sind so konzipiert, dass sie das veränderte Spleißen der SMN2-Prä-mRNA so verändern, dass Exon 7 in das endgültige prozessierte Transkript aufgenommen wird. Wie bereits in früheren Kapiteln besprochen, unterscheidet sich SMN2 von SMN1 durch einen C-zu-T-Übergang, der sechs Nukleotide in Exon 7 stattfindet (es gibt noch weitere Unterschiede zwischen den beiden Sequenzen, aber dies ist funktionell der wichtigste). Der C-zu-T-Übergang schafft einen ausgedehnten inhibitorischen Kontext in Exon 7 (auch als „Exinct“ bekannt).63 Da Exon 7 aufgrund einer schwachen 5′-Spleißstelle ansonsten nur schwach definiert ist, reicht die C-zu-T-Mutation in SMN2 aus, um das Gleichgewicht zwischen Einschluss und Ausschluss zu kippen.
Regulatorische Elemente für das Spleißen spielen eine wichtige Rolle bei der Bestimmung, welche Stellen von der zellulären Spleißmaschinerie erkannt werden. Die Lage und Funktion relevanter SMN2-Elemente wurde durch die Analyse des Spleiß-Effekts einer umfangreichen Reihe von ASOs identifiziert, die entwickelt wurden, um die SMN2-Sequenz in einer progressiven, iterativen Weise zu ergänzen.6366 Der intronische Spleiß-Silencer ISS-N1 wurde mit dieser Methode als ein sehr leistungsfähiges Silencing-Element identifiziert; das Motiv befindet sich stromabwärts der 5′-Spleißstelle von Exon 7 und bindet an den Spleiß-Repressor hnRNP A1.66-68 ASOs wurden so konzipiert, dass sie die Inklusion von Exon 7 zuverlässig induzieren, indem sie auf ISS-N1 oder andere regulatorische Elemente abzielen.
ASOs können so konzipiert werden, dass sie bifunktionell sind. So wurde beispielsweise gezeigt, dass chimäre ASOs, die SR-Rekrutierungsdomänen (RS-Peptid) mit einer Antisense-Sequenz fusionieren, die Silencer-Motive unterdrückt, den Einschluss von Exon 7 und den SMN-Proteinspiegel in Patientenfibroblasten erhöhen; eine einzige Injektion des bifunktionalen ASO konnte das SMN-Protein im Gehirn neugeborener Mäuse induzieren und führte zu einer verlängerten Lebensspanne.65,69 Diese ASO-Designstrategie, bekannt als ESSENCE (exon-spezifische Spleißverbesserung durch kleine chimäre Effektoren), wurde zunächst für SMA-Therapien verfolgt, aber spätere Studien zeigten, dass das RS-Peptid nicht notwendig war, um eine robuste Wirkung auf die SMN2-Exon-7-Inklusion zu erzielen. Da ein chimärer Ansatz Schwierigkeiten bei der Herstellung des ASO mit sich bringt und die zelluläre Permeabilität des ASO einschränkt, wurden bifunktionelle ASOs nicht ausgiebig an Mäusen getestet und werden derzeit nicht klinisch entwickelt.62
Nachdem gezeigt wurde, dass ASOs, die auf ISS-N1 abzielen, bei der Förderung des Einschlusses von Exon 7 bemerkenswert wirksam sind, bestand die nächste strategische Frage darin, zu ermitteln, welches ASO-Grundgerüst am besten für eine potenzielle SMA-Therapie geeignet wäre. Die Oligonukleotide, aus denen ein ASO besteht, werden in der Regel modifiziert, um pharmazeutische Eigenschaften wie Zellaufnahme, Toxikologie, Pharmakokinetik und Zielbindung zu optimieren. Eine gemeinsame Anpassung, die aus einer Zusammenarbeit zwischen Ciba-Geigy Ltd. (heute Novartis) und Isis Pharmaceuticals (heute Ionis Pharmaceuticals) hervorgegangen ist, ist das 2′-O-Methoxyethyl (2′-MOE), das sowohl die ASO-Resistenz gegenüber Nuklease-Abbau als auch die Hybridisierungsaffinität erhöht.70 2′-MOE-Oligonukleotide haben sich bei Nagetieren und Primaten, einschließlich Menschen, als sehr sicher erwiesen.62 Die Verabreichung eines 2′-MOE-ASOs, das ISS-N1 blockiert, führte bei SMA-Mäusen zu einer dosis- und zeitabhängigen Erhöhung des SMN2-Exons 7, wodurch sich die neuromuskuläre Pathologie verbesserte und die Überlebensrate drastisch anstieg.68,71,72 Ionis Pharmaceuticals entwickelt in Zusammenarbeit mit Biogen eine 2′-MOE-ASO-Therapie namens Nusinersen (auch bekannt als IONIS-SMNRx und früher ISIS-SMNRx). Präklinische Studien mit Nusinersen an nicht-menschlichen Primaten haben gezeigt, dass eine einzige intrathekale Injektion zu den Gewebskonzentrationen führen kann, die für eine signifikante Verbesserung der Exon-7-Inklusion erforderlich sind, und dass diese Konzentrationen über mehrere Monate aufrechterhalten werden können.62 Die lange Halbwertszeit des Medikaments bedeutet, dass die Patienten möglicherweise nur alle paar Monate eine intrathekale Injektion benötigen.73 In einer offenen Phase-1-Studie bei SMA-Typ-II/III-Patienten im Alter von 2-14 Jahren wurde eine einzelne Injektion von Nusinersen gut vertragen und scheint bei der höchsten Dosierung mit einer Verbesserung der HFMSE-Scores korreliert zu sein.74 Im Juni 2015 veröffentlichte Ionis neue Daten aus einer laufenden offenen Phase-2-Studie mit Nusinersen bei Typ-I-Kindern, die zeigten, dass die Kinder länger lebten und mehr motorische Meilensteine erreichten, als aufgrund des natürlichen Krankheitsverlaufs normalerweise zu erwarten wäre.75 Darüber hinaus wurde der Wirkmechanismus des Medikaments durch Daten untermauert, die einen Anstieg der Menge an SMN2-mRNA in voller Länge und des SMN-Proteins in Gehirn- und Rückenmarksgewebe aus Autopsien von behandelten Patienten zeigten. Ionis veröffentlichte außerdem Daten aus der offenen Phase-2-Verlängerungsstudie bei Kindern mit SMA Typ II/III, die zeigen, dass 57 % der Probanden eine Verbesserung von mindestens drei Punkten auf dem HFMSE-Test und eine durchschnittliche Verbesserung von 55 m auf dem 6-Minuten-Gehtest (6MWT) erreichten.76 Phase-3-Studien mit Nusinersen werden derzeit sowohl bei Säuglingen als auch bei Erwachsenen mit SMA durchgeführt (NCT02193074; NCT02292537); die Ergebnisse sollten 2017 vorliegen.
Obwohl bei der Verwendung von 2′-MOE in der SMA-Therapie bisher keine Sicherheitsprobleme beobachtet wurden, wurden einige Toxizitäten mit 2′-MOE-ASOs in anderen Patientengruppen in Verbindung gebracht.77,78 Eine weitere Backbone-Modifikation, die für den Einsatz bei SMA erforscht wird und die diese Probleme umgehen könnte, sind Phosphoramidat-Morpholino-Oligomere (PMOs). PMOs haben sich in Mausmodellen der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD), einer anderen neuromuskulären Kinderkrankheit, als wirksamer erwiesen als 2′-MOE und wurden auch von DMD-Patienten gut vertragen.79 Eine ICV-Injektion von Morpholino-ASOs, die komplementär zu ISS-N1 sind, verbesserte das Überleben von SMA-Mäusen signifikant und ohne Anzeichen von Toxizität im zentralen Nervensystem (ZNS).80,81 Ein Morpholino, das auf ISS-E1 abzielt, einen intronischen Spleiß-Silencer, der sich stromaufwärts von Exon 7 befindet, verbessert ebenfalls den Phänotyp von SMA-Mäusen.82 Dieser Ansatz wurde bisher noch nicht in die Klinik eingeführt.
Die chemische Zusammensetzung des Grundgerüsts eines ASO kann sich auf die Eignung für verschiedene Verabreichungsmethoden, die Notwendigkeit wiederholter Verabreichung und die damit verbundenen Toxizitäten auswirken – all dies hat wichtige Auswirkungen auf seine therapeutische Verwendung. Darüber hinaus muss ein ASO, der zur Behandlung von SMA eingesetzt wird, in den Geweben des ZNS, insbesondere in den Motoneuronen, pharmakologisch aktiv bleiben. Unabhängig vom Grundgerüst muss jedes ASO, das für die SMA-Therapie entwickelt wird, wahrscheinlich direkt in die Zerebrospinalflüssigkeit durch intrathekale Injektion verabreicht werden. Obwohl einige Studien mit peripherer ASO-Verabreichung bei neugeborenen Mäusen Wirksamkeit zeigten, ist die Blut-Hirn-Schranke bei jungen Mäusen noch nicht vollständig ausgebildet, und ein peripher verabreichtes ASO kann das ZNS in einem Maße durchdringen, wie es beim Menschen nicht möglich ist.71 Ermutigend ist, dass sich intrathekal injizierte ASOs nachweislich in wichtigen ZNS-Geweben wie Motoneuronen, Astrozyten und Mikroglia verteilen.72,83-85
Obwohl die intrathekale Injektion etwas invasiv ist und eine Sedierung oder Anästhesie erfordert, haben ASOs mehrere bedeutende Vorteile gegenüber anderen experimentellen Modalitäten, einschließlich hoher Zielspezifität, bemerkenswerter Wirksamkeit, geringer Toxizität im Vergleich zur systemischen Verabreichung von ASOs und relativ einfacher Herstellungsprozesse im Vergleich zu Biologika (aber nicht zu kleinen Molekülen). Weitere Informationen finden Sie in Kapitel 18.