Aufklärung der funktionellen Rolle von Mycobacterium smegmatis recX bei der Stressreaktion

Hypoxie bewirkt einen Anstieg der Expression von M. smegmatis recA- und recX-Genen

Im Verlauf der Infektion und Vermehrung ist M. tuberculosis physiologischen Stressbedingungen wie Hypoxie und saurem pH-Stress ausgesetzt, die sein Überleben gefährden könnten38,39,40. Akuter hypoxischer Stress beispielsweise stoppt die DNA-Replikation und löst starke DNA-Schäden aus41,42,43. Die Expression von Genen des SOS-Wegs, einschließlich umuDC, polB, recN, sulA, uvrA, uvrB und uvrD, beginnt bei DNA-Schäden44,45,46. Zu diesem Zweck hat die Erstellung von Hypoxie-induzierten Genexpressionsprofilen in M. smegmatis und M. tuberculosis während einer latenten Infektion wertvolle Erkenntnisse über die Natur latenter Tuberkelbazillen und deren Behandlung geliefert47.

Vorangegangene Studien in M. tuberculosis48, Thiobacillus ferrooxidans49 und Streptomyces lividans50 haben gezeigt, dass recA zusammen mit recX transkribiert wird. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass eine Überexpression von RecA (ein positiver Regulator der SOS-Reaktion) in Abwesenheit von RecX bei bestimmten Bakterienarten wie Pseudomonas aeruginosa51, S. lividans50, M. smegmatis52 und Xanthomonas oryzae53 toxisch ist. Diese Ergebnisse stimmen mit der Vorstellung überein, dass RecX als Anti-Rekombinase fungiert, um von RecA14 geförderte unangemessene Rekombinationsereignisse zu unterdrücken. Im Gegensatz dazu ist eine Überexpression von RecA im ΔrecX-Stamm von E. coli nicht schädlich, und die Deletion von recX hat keine Auswirkungen auf die recA-Expression54. Die Transkription von recX wird in E. coli im Vergleich zu recA unter normalen Wachstumsbedingungen herunterreguliert, da sich zwischen den kodierenden Sequenzen von recA und recX eine Transkriptionsterminationsstelle befindet. Ein recA-recX-mRNA-Transkript, das aus dem transkriptionellen Read-Through resultiert, akkumuliert jedoch im Bereich von 5-10 % des gesamten recA-mRNA-Gehalts54. Das recX-Transkript war während des vegetativen Wachstums von E. coli kaum nachweisbar, aber eine robuste Expression von recX tritt nach einer Behandlung mit DNA-schädigenden Substanzen auf15,55.

Die Genome von M. smegmatis und M. tuberculosis enthalten jeweils eine einzige Kopie von recA und recX in einem einzigen Operon. Um die Expression und Regulierung dieser Gene unter aerobem und hypoxischem Wachstum in M. smegmatis, einem häufig verwendeten Surrogatmodell für M. tuberculosis, zu untersuchen, wurde die relative Abundanz der mRNA in verschiedenen Wachstumsphasen mit einem RT-qPCR-Assay gemessen und auf die des konstitutiv exprimierten 16S rRNA-Gens normalisiert. Die Zyklusschwellenwerte (Ct) für M. smegmatis recA und recX mRNA wurden gegen den Ct-Wert des 16S rRNA-Gens normalisiert. Im Gegensatz zu E. coli15,55 wurden sowohl unter aeroben als auch unter hypoxischen Kulturbedingungen signifikante Mengen an recA mRNA-Transkripten in der frühen Log-Phase beobachtet (Abb. 1A). Interessanterweise verstärkte sich unter hypoxischen Bedingungen die Akkumulation von recA mRNA in der mittleren log-Phase um das 1,5-fache und nahm danach ab, als die Zellen in die stationäre Phase eintraten. Ein ähnliches Muster wurde bei der recX-mRNA-Häufigkeit sowohl unter aeroben als auch unter hypoxischen Bedingungen beobachtet, wenn auch auf niedrigerem Niveau (Abb. 1B). Diese Beobachtungen unterstützen die Idee, dass die beiden Gene unter aeroben und hypoxischen Wachstumsbedingungen gemeinsam transkribiert und koordiniert reguliert werden. Interessanterweise wurde kein Unterschied in den mRNA-Mengen unter aeroben und hypoxischen Wachstumsbedingungen in der frühen Log-Phase festgestellt. Anhand der Transkriptionsprofile der M. smegmatis-Wachstumsphasen-spezifischen Markergene (sigH2 und sigH7)56 wurden die Zeitpunkte der frühen Log-, der mittleren Log- und der stationären Phase ermittelt (Abb. 1C). Bei multiresistenten klinischen Stämmen von M. tuberculosis wurde festgestellt, dass die Konzentrationen sowohl von recA als auch von recX mRNA höher sind als bei den medikamentenempfänglichen Stämmen, und die Konzentrationen von recX mRNA stiegen gleichzeitig mit einem Anstieg von recA mRNA57.

Es ist jedoch zu beachten, dass die mRNA-Werte nicht als Ersatz für die entsprechenden Proteingehalte verwendet werden können. Daher wurde die Häufigkeit der RecA- und RecX-Proteine in M. smegmatis unter aeroben und hypoxischen Bedingungen mit einem Western-Blot-Assay unter Verwendung von Anti-RecA- und Anti-RecX-Antikörpern gemessen. GroEL wurde als Protein-Beladungskontrolle untersucht. Die densitometrische Analyse der Immunoblots zeigte, dass die Zellen unter hypoxischen Wachstumsbedingungen höhere RecA-Konzentrationen anhäuften als unter aeroben Bedingungen (Abb. 2A,B). Eine vergleichende Analyse zeigte, dass die Zellen unter aeroben Wachstumsbedingungen in der mittleren Log-Phase durchweg 2-fach höhere RecA-Konzentrationen anhäuften als in der frühen Log-Phase, die in der stationären Phase auf die Werte in der frühen Log-Phase zurückgingen (Abb. 2A,B). Ein ähnliches Muster wurde für RecX beobachtet, wenngleich die Werte weniger ausgeprägt waren als die von RecA (Abb. 2A,C). Obwohl die mRNA- und Proteinexpressionsmuster vergleichbar waren, wurden wichtige Unterschiede festgestellt. Erstens war das RecX-Protein in der frühen Log-Phase unter hypoxischen Bedingungen kaum nachweisbar. Zweitens war die Abundanz von RecA-mRNA und -Protein im Vergleich zu RecX höher.

Obwohl diese Ergebnisse darauf hindeuten, dass die recA- und recX-Gene von M. smegmatis unter hypoxischen Bedingungen induziert werden, gibt es keine Korrelation zwischen der Menge der recX-mRNA und dem entsprechenden Protein in der frühen Log-Phase. Sowohl bei M. tuberculosis als auch bei M. smegmatis wurde gezeigt, dass sie ihre mRNA-Transkripte unter wachstumshemmenden Bedingungen stabilisieren58,59,60. Zu den möglichen Mechanismen gehören die tRNA-Umprogrammierung und die selektive kodonabhängige Translation, die bei Mykobakterien als Reaktion auf Hypoxie eine Rolle spielen61. Eine mögliche Erklärung für die fehlende Korrelation zwischen dem recX mRNA- und dem Proteingehalt in der frühen log-Phase könnte die translatorische Unterdrückung der recX mRNA sein.

Konstruktion von ΔrecX- und ΔrecA ΔrecX-Mutantenstämmen

Die unterschiedlichen RecA- und RecX-Proteinspiegel in M. smegmatis deuten auf eine mögliche Regulierung der Genexpression auf der Ebene der Transkription hin. In vielen bisher untersuchten Bakterien befindet sich das recX-Gen auf demselben kodierenden Strang stromabwärts von recA, und die beiden Gene werden gemeinsam transkribiert48,50,53,54,62,63. Im lexA-recA-recX-Locus von Xanthomonas Pathovars wird jedoch jedes Gen von seinem eigenen Promotor exprimiert64. In D. radiodurans65,66, B. subtilis67 und N. gonorrhoeae26 sind die recA- und recX-Gene durch mehrere hundert kb Länge voneinander getrennt und werden von ihren eigenen Promotoren transkribiert.

In einer Reihe von Mykobakterienarten sowie in einigen anderen Bakterien überlappt die 5′-Region der recX-Kodierungssequenz die 3′-Region des recA-Gens. Die Überlappung ist bei M. smegmatis48 32 bp lang, während sie bei M. tuberculosis68 und M. leprae69 35 bp beträgt. Die Auswirkungen der Deletion von recX auf die phänotypischen Merkmale wurden bei verschiedenen Organismen untersucht7,10. Die Knockout-Mutanten von recX zeigen eine Reihe von Phänotypen, die mit den RecA-Funktionen in Zusammenhang stehen: Die Inaktivierung von B. subtilis recX machte die Zellen empfindlich gegenüber MMS und H2O225, die S. lividans recX-Mutanten zeigten eine verringerte Resistenz gegenüber UV-Schäden42 und die N. gonorrhoeae recX-Mutante zeigte eine geringfügige Verringerung ihrer Fähigkeit, DNA-Schäden zu überleben, die durch Doppelstrangbrüche verursacht wurden26. Die Auswirkungen der Deletion sowohl der recA- als auch der recX-Gene auf die Wachstumseigenschaften und die Reparatur von DNA-Schäden wurden jedoch noch bei keinem Organismus untersucht. Außerdem ist die Rolle von recX in Mykobakterien in vivo noch nicht vollständig geklärt.

Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass der ΔrecA-Stamm von M. smegmatis empfindlich auf UV-induzierte DNA-Schäden reagiert und keine HR52 fördert. Wir haben die recA-Mutation mit der Deletion von recX kombiniert, um die Auswirkungen der Doppelmutationen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden M. smegmatis mc2155 recX-Einzel- und recArecX-Doppelmutantenstämme erzeugt. Als Kontrolle wurde die Auswirkung der recA-Deletion in M. smegmatis zum direkten Vergleich erneut ausgewertet. Mithilfe der Rekombinierungsmethode, die auf einem für M. tuberculosis und M. bovis BCG28 entwickelten Protokoll basiert, wurden die M. smegmatis mc2155 ΔrecA- und ΔrecAΔrecX-Mutanten unter Verwendung von 3,279 kb und 3,302 kb linearen ΔrecA::hyg- bzw. ΔrecAΔrecX::hyg-AES-Konstrukten erzeugt. Ungefähr 100 ng linearer AES-DNA-Fragmente wurden durch Restriktionsverdau der jeweiligen Plasmide mit EcoRV erzeugt (Abb. 3A). Diese wurden in kompetente M. smegmatis mc2155:pJV53 Rekombinationszellen70 transformiert. Nach 4-5 Tagen Inkubation wurden 8-10 Hyg-resistente Kolonien für die ΔrecX- und ΔrecAΔrecX-Mutanten gefunden. Die mutmaßlichen Mutantenstämme wurden mittels PCR untersucht, um festzustellen, ob die recX- und recArecX-Gene aus dem Chromosom entfernt wurden (Daten nicht gezeigt). Die korrekten Mutanten wurden in 7H10 Middlebrook-Agar-Medium für 5-8 Generationen gezüchtet, um den Verlust von pJV53 zu ermöglichen.

Genotypische und phänotypische Analyse von M. smegmatis ΔrecX- und ΔrecAΔrecX-Mutanten

Nach einem PCR-Screening wurden jeweils 2 der ΔrecX- und ΔrecAΔrecX-Knockout-Mutanten von M. smegmatis mc2155 erhalten. Die ΔrecX- und ΔrecAΔrecX-Mutanten wurden durch Restriktionsenzymkartierung und Southern-Blot-Hybridisierung charakterisiert (Abb. 3). Bei der Hybridisierung mit entsprechenden radioaktiv markierten Sonden wurde im Fall der Wildtyp-M. smegmatis mc2155-Zellen ein 4,1 kb-Fragment festgestellt. Die vorhergesagten 3,14 kb und 2,09 kb Fragmente wurden in den ΔrecX- bzw. ΔrecAΔrecX-Mutanten beobachtet (Abb. 3B,C). Beide Banden sind kleiner als 4,1 kb, was darauf hindeutet, dass die recX- und recArecX-Gene durch Allelaustausch deletiert worden sind. Die Häufigkeit des Allelaustauschs bei recX und recArecX lag im Bereich von 70 % bzw. 80 %.

Eine Einschränkung dieser Analyse besteht darin, dass die beobachteten Auswirkungen der ΔrecX- und ΔrecAΔrecX-Mutationen auf die polaren Effekte der Hygromycin-Resistenzgen-Insertion zurückzuführen sein könnten. Generell könnten genetische Veränderungen um den recA-recX-Locus zu polaren Effekten auf die Expression von Genen führen, die dem recA-recX-Locus nachgeschaltet sind. Es wurden zwei unabhängige Experimente durchgeführt, um die potenziellen polaren Effekte zu untersuchen. Zunächst wurden die ΔrecX- und ΔrecAΔrecX-Mutanten mit den funktionalen Kopien der recA- und recX-Gene ergänzt. Die Transformanten wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, in einem Standardkulturmedium zu wachsen und die mutierten Zellen vor UV-Bestrahlung zu schützen. Zehnfache serielle Verdünnungen wurden auf 7H10-Agarplatten aufgetragen und analysiert. Wie in Abb. 4A und B zu sehen ist, ergänzte der Wildtyp recA teilweise die ΔrecA- und ΔrecAΔrecX-Mutantenstämme, was sich aus ihrer Fähigkeit ableiten lässt, das Wachstum zu fördern und Schutz vor UV-Bestrahlung zu bieten. Wildtyp recX konnte jedoch den Phänotyp der ΔrecAΔrecX-Mutantenstämme, der bei der Induktion von DNA-Schäden durch UV-Bestrahlung beobachtet wurde, nicht retten. Da die Deletion von recX keine erkennbare Auswirkung auf das Wachstum unter normalen und DNA-schädigenden Bedingungen hatte, zeigten ΔrecX und der entsprechende komplementierte Stamm ein ähnliches Wachstum wie der Wildtyp.

Zweitens haben wir die Expression von zwei M. smegmatis mc2155, gluD (MSMEG_2725) und glnH (MSMEG_2726), die stromabwärts des recA-recX-Lokus in den ΔrecA-, ΔrecX- und ΔrecX-Mutantenstämmen im Vergleich zum Wildtyp-Stamm liegen. Das M. smegmatis hyd2 (MSMEG_2720) Gen, das stromaufwärts des recA-recX Locus liegt, wurde als Positivkontrolle verwendet. Die Gesamt-RNA wurde aus den Wildtyp-, ΔrecA-, ΔrecX- und ΔrecX-Mutantenstämmen hergestellt. Die relativen Abundanzen der Gentranskripte wurden mittels quantitativer RT-qPCR bestimmt und auf das konstitutiv exprimierte chromosomale 16S rRNA-Gen normiert. Die Expressionswerte wurden an Zellen gemessen, die in der späten exponentiellen Wachstumsphase gewachsen waren. In allen Fällen waren die Genexpressionsprofile sowohl der stromaufwärts als auch der stromabwärts gelegenen ORFs bei den Wildtyp- und Mutantenstämmen ähnlich (Abb. 4C). Zusammengenommen schließen diese Ergebnisse die Möglichkeit aus, dass die Insertion des Hygromycin-Resistenzgens polare Effekte verursacht.

Die M. smegmatis ΔrecA- und ΔrecA ΔrecX-Mutantenstämme zeigen im Vergleich zum Wildtyp-Stamm ein beeinträchtigtes Wachstum und eine verringerte Zellausbeute

Um die M. smegmatis ΔrecX- und ΔrecA ΔrecX-Mutantenstämme zu charakterisieren, wurden die Wachstumsprofile der Wildtyp- und Knockout-Stämme in 7H9 Middlebrook-Bouillon bei 37 °C gemessen (Abb. 5). Die recX-Deletion hatte (im Vergleich zum Wildtyp-Stamm) keinen erkennbaren Einfluss auf das Wachstum von M. smegmatis. Unter ähnlichen Bedingungen führte die Deletion von recA zu einer deutlichen Verlängerung der Lag-Phase und zu einer gleichzeitigen Verkürzung der exponentiellen Wachstumsphase, was darauf hindeutet, dass recA eine Rolle für das Wachstum und die Lebensfähigkeit von M. smegmatis spielt. Darüber hinaus stehen diese Ergebnisse im Einklang mit der bekannten Funktion von recA bei der Rettung von blockierten oder kollabierten Replikationsgabeln71,72,73. Da die recA- und recX-Gene ein einziges Operon bilden, wurden die Auswirkungen ihrer Deletion auf das Wachstum von M. smegmatis untersucht. Der ΔrecA-ΔrecX-Knockout-Stamm wies einen Wachstumsphänotyp auf, der zwischen der ΔrecA-Mutante und dem Wildtyp-Stamm lag; das Wachstum in der späten logarithmischen Phase und in der stationären Phase war jedoch ähnlich wie bei den ΔrecA- und Wildtyp-Stämmen.

Die Deletion von recA, aber nicht von recX, macht M. smegmatis anfälliger für DNA-schädigende Substanzen

Gleich anderen Eubakterien spielt das mykobakterielle RecA-Protein eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der SOS-Reaktion auf DNA-Schäden74,75,76,77. Um zu testen, ob das Fehlen von recArecX und recX die Fähigkeit von M. smegmatis, geschädigte DNA effektiv zu reparieren, beeinträchtigt, wurden die Mutanten einer Reihe von Agenzien mit unterschiedlichen Mechanismen der DNA-Schädigung ausgesetzt. In diesen Experimenten wurde Stress induziert, indem die ΔrecA-, ΔrecX- und ΔrecA ΔrecX-Mutantenstämme während der exponentiellen Phase (OD600 von 0,6) des Bakterienwachstums UV-Strahlung, MMS, H2O2 oder Ciprofloxacin ausgesetzt wurden. Nach dreistündiger Inkubation wurden die Zellen gewaschen und ihre Lebensfähigkeit durch Tupfen von zehnfachen seriellen Verdünnungen der Kulturen auf Middlebrook-7H10-Agarplatten mit Hygromycin (100 µg/ml) bestimmt. Die am besten geeignete Konzentration/Dosis der DNA-schädigenden Mittel wurde nach Auswertung der Unterschiede in der Zelllebensfähigkeit zwischen den Stämmen mithilfe von Plattentests bestimmt. In Abwesenheit von DNA-schädigenden Mitteln wiesen alle Stämme ähnliche Werte der Zelllebensfähigkeit auf (Abb. 6). Im Gegensatz dazu zeigte der ΔrecA-Stamm in Gegenwart von DNA-schädigenden Substanzen einen ausgeprägten Wachstumsdefekt, der mit einer 100-fachen Abnahme der Ausplattierungseffizienz im Vergleich zum Wildtyp-Stamm einherging. Dieser Phänotyp stimmt mit der verfügbaren Literatur überein. Im Gegensatz dazu wurde die tödliche Wirkung von UV, MMS oder Ciprofloxacin, aber nicht von H2O2, durch Deletion des recX-Gens im ΔrecA-Stamm teilweise blockiert. Obwohl die Grundlage für die fehlende H2O2-Wirkung nicht klar ist, war die verwendete Konzentration wahrscheinlich nicht hoch genug, um das Wachstum zu beeinträchtigen. Interessanterweise zeigte der ΔrecX-Stamm einen etwas resistenteren Phänotyp gegen alle vier DNA-schädigenden Agenzien als der ΔrecA-ΔrecX-Stamm, was auf einen möglichen Funktionsgewinn durch den Verlust des recX-Gens hinweist. Angesichts dieser Ergebnisse ist es offensichtlich, dass recA eine aktive Rolle bei der SOS-Antwort spielt und dass die Empfindlichkeit gegenüber DNA-schädigenden Substanzen im ΔrecX-Stamm leicht unterdrückt ist.

Überleben nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von DNA-schädigenden Mitteln

Mykobakterien sind einer Reihe von ungünstigen Stressbedingungen ausgesetzt, wie z. B. oxidativem, ernährungsbedingtem und medikamenteninduziertem Stress78,79,80,81,82. Um die Unterschiede in der Lebensfähigkeit der Zellen weiter zu untersuchen, wurden Experimente durchgeführt, bei denen die Lebensfähigkeit der Zellen anhand von Koloniebildungseinheiten (KBE) gemessen wurde. Zunächst wurde die Lebensfähigkeit der M. smegmatis mc2155 ΔrecA-, ΔrecX- und ΔrecAΔrecX-Mutanten im Vergleich zu der des Wildtyps getestet, indem sie mit steigenden Konzentrationen von MMS behandelt wurden. Die Stämme wurden in Gegenwart der angegebenen MMS-Konzentrationen gezüchtet, bis die Kulturen eine OD600 von 0,6 erreichten. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Ausplattieren einer bestimmten Anzahl von Zellen auf 7H10-Agarplatten bestimmt. Die Zellen wurden als lebendig eingestuft, wenn sie in der Lage waren, sich zu teilen und Kolonien zu bilden. Die Mutanten zeigten im Gegensatz zum Wildtyp-Stamm eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber MMS in Abhängigkeit von der Konzentration. Die quantitative Analyse zeigte, dass die ΔrecA-Mutante eine relativ höhere Empfindlichkeit gegenüber MMS aufwies, die mit steigender MMS-Konzentration zunahm (Abb. 7A). Im Fall von ΔrecX waren die Zellen im Vergleich zu den ΔrecA-Zellen etwa 2-fach weniger empfindlich gegenüber MMS. Andererseits zeigte die ΔrecA-ΔrecX-Mutante eine höhere Empfindlichkeit gegenüber MMS im Gegensatz zur ΔrecX-Mutante. Die Empfindlichkeit der ΔrecX-Mutante gegenüber MMS deutet darauf hin, dass recX neben RecA auch noch nicht identifizierte Ziele haben könnte. Diese Vermutung muss weiter untersucht werden.

Nächstens wurden die Empfindlichkeiten der M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX und ΔrecA ΔrecX-Mutantenstämme im Vergleich zum Wildtyp-Stamm bestimmt, indem sie steigenden Konzentrationen von H2O2 ausgesetzt wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die ΔrecA-Mutante gegenüber dieser Behandlung weniger empfindlich war (Abb. 7B). Die Deletion von recX allein oder die Deletion des recA-recX-Locus hatte nur eine geringe Auswirkung auf die Lebensfähigkeit und Vermehrung der mutierten Zellen als Reaktion auf die H2O2-Behandlung. Bemerkenswert ist, dass die ΔrecA- und ΔrecAΔrecX-Mutantenstämme einen empfindlichen Wachstumsphänotyp gegenüber UV-Bestrahlung und Ciprofloxacin aufweisen, der deutlich stärker ist als der gegenüber MMS oder H2O2 (Abb. 7C,D). Außerdem zeigte der ΔrecA-Stamm eine größere Empfindlichkeit gegenüber UV-Bestrahlung und Ciprofloxacin als der ΔrecA-ΔrecX-Doppelmutantenstamm.

Die Expression der recA- und recX-Gene wird durch DNA-Schäden induziert

Die regulatorischen Elemente stromaufwärts des recA-Gens sind nicht in allen Mykobakterienarten konserviert. So wird das recA-Gen von M. tuberculosis von zwei Promotoren transkribiert: beide sind durch DNA-Schäden induzierbar, wenn auch über unterschiedliche Mechanismen. Der Promotor P1 von M. tuberculosis recA (proximal zum Startcodon) kann nach einer DNA-Schädigung unabhängig von den Proteinen LexA und RecA induziert werden. Im Gegensatz dazu wird der Promotor P2 (entfernt vom recA-Startcodon) durch LexA reguliert, was funktionell dem E. coli recA-Promotor entspricht83,84,85. Interessanterweise ist der Mechanismus der Induktion von DNA-Schäden in M. tuberculosis nicht vollständig in M. smegmatis konserviert46,75. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, die Expression und Regulierung der recA- und recX-Gene von M. smegmatis und ihre Rolle bei der Reaktion auf DNA-schädigende Substanzen zu verstehen.

Wie oben beschrieben, führte Hypoxie zu einem Anstieg der Expression der recA- und recX-Gene von M. smegmatis (Abb. 1). Um die Annahme zu untermauern, dass die Expression der M. smegmatis recA- und recX-Gene schadensinduzierbar ist, wurde die Kinetik der Induktion mit und ohne DNA-Schaden mittels RT-qPCR bestimmt. Die Gesamt-RNA-Proben wurden aus M. smegmatis-Zellen, die 0, 3, 6, 9 und 12 Stunden nach der UV-Bestrahlung geerntet wurden, sowie aus unbehandelten Kulturen hergestellt und wie im Abschnitt Methoden beschrieben analysiert. Die Ergebnisse zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den recA- und recX-Transkriptspiegeln in unbehandelten Zellen. Im Gegensatz dazu wurde 3 Stunden nach der UV-Bestrahlung ein deutlicher Anstieg der recA- und recX-mRNA-Transkripte beobachtet, der danach wieder leicht abnahm. Ein Vergleich der RT-qPCR-Daten zeigt wichtige Unterschiede zwischen den recA- und recX-Transkriptmengen. Die UV-Bestrahlung führte zu einem ~8-fachen Anstieg der recA mRNA im Vergleich zur Kontrolle, während recX um das ~3-fache anstieg (Abb. 8A,B). Obwohl recA und recX mRNA in der gleichen Transkriptionseinheit existieren, unterstützen diese Ergebnisse die Idee, dass die Produktion und/oder Stabilität des recX mRNA-Transkripts einem zusätzlichen posttranskriptionalen Regulationsmechanismus unterliegt.

Diese Ergebnisse veranlassten uns, zusätzliche Experimente durchzuführen, um die Kinetik der Akkumulation von RecA- und RecX-Proteinen in M. smegmatis-Zellen mit oder ohne DNA-Schäden zu bestimmen. Mit polyklonalen Antikörpern gegen RecA und RecX wurden Western-Blotting-Tests an Ganzzelllysaten durchgeführt (Abb. 8C). Die Quantifizierung der Western Blots zeigte, dass die Zellen in den nicht induzierten Zellen signifikante Mengen sowohl an RecA- als auch an RecX-Proteinen enthielten (Abb. 8D, E). Im Vergleich dazu wurde in den Zellen 3 Stunden nach der UV-Bestrahlung ein 2-facher Anstieg der Abundanz von RecA und RecX (im Vergleich zur Kontrolle) festgestellt, der danach wieder abnahm. Wichtig ist, dass die Induktion von RecA- und RecX-Proteinen ein Muster aufweist, das an das Muster in Zellen unter hypoxischen Bedingungen erinnert (Abb. 2), obwohl die Mechanismen, durch die sie die DNA schädigen, wahrscheinlich unterschiedlich sind.

Abschließende Bemerkungen

Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass recA und recX eine breite Palette von Funktionen im Zusammenhang mit der DNA-Reparatur und Rekombination ausüben7,10. Unseres Wissens sind die Stimuli, die die Expression der recA- und recX-Gene von M. smegmatis aktivieren, noch nicht identifiziert worden. In dieser Studie wurde das Expressionsniveau dieser Gene in Zellen bei aerobem Wachstum und als Reaktion auf verschiedene Stressbedingungen untersucht. Bei M. smegmatis gehören recA und recX, wie bei vielen Bakterienarten, zum selben Operon, und das recX-Gen befindet sich unmittelbar stromabwärts des recA-Gens, wobei sich die kodierenden Regionen überschneiden86. Es wurde festgestellt, dass DNA-schädigende Agenzien die Expression beider Gene in unterschiedlichem Ausmaß induzieren; die Expressionsverhältnisse folgen jedoch einem ähnlichen Muster. Interessanterweise bleiben die Konzentrationen sowohl von RecA als auch von RecX unter Stressbedingungen im Vergleich zu aeroben Wachstumsbedingungen hoch.

Mehrere Studien haben alternative Rollen für recX bei der rekombinanten DNA-Reparatur, die von RecA gefördert wird, aufgezeigt. Während das RecX-Protein physisch mit RecA interagiert und als potenter Inhibitor aller bekannten Funktionen von RecA in vielen Bakterienarten fungiert14,46,48, potenziert es die homologe Rekombination in N. gonorrhoeae und B. subtilis25,26. Um Einblicke in die Rolle von recX bei der Stressreaktion in Mykobakterien zu gewinnen, wurden Knockout-Mutanten von M. smegmatis recX und recArecX konstruiert. Interessanterweise führte die Deletion von recX in M. smegmatis zu einem etwas resistenteren Phänotyp gegenüber allen vier DNA-schädigenden Substanzen, was auf einen möglichen Funktionsgewinn durch den Verlust des recX-Gens hindeutet. Die molekulare Grundlage dieses Effekts ist nicht klar, was in zukünftigen Studien untersucht werden sollte. Während sich unsere Analyse hauptsächlich auf die genetische Interaktion zwischen recA und recX im rekombinanten DNA-Reparaturweg konzentrierte, scheint recX interessanterweise eine wichtige Rolle beim bakteriellen Wachstum zu spielen. Zusammenfassend stimmen diese Ergebnisse mit der Idee überein, dass M. smegmatis recX eine wichtige Rolle bei DNA-Reparatur-/Rekombinationsprozessen unter ungünstigen Bedingungen spielt, vielleicht durch Regulierung der schädlichen Auswirkungen einer Untergruppe der noch unbekannten Gene.

Verwendete Abkürzungen sind

DTT, Dithiothreitol; EDTA, Ethylendiamintetraessigsäure; kb, Kilobase; MMS, Methylmethansulfonat; ODN, Oligonukleotid; PAGE, Polyacrylamidgelelektrophorese; PVDF, Polyvinylidendifluoridmembran; RT-qPCR, quantitative Polymerasekettenreaktion mit reverser Transkription; SDS, Natriumdodecylsulfat; ssDNA, einzelsträngige DNA; SSC, 0.15 M NaCl-0,015 M Natriumcitrat (pH 7,0) Puffer.