Nukleinsäuren
Wie viele biologische Moleküle sind Nukleinsäuren Polymere, lange Moleküle, die aus sich wiederholenden Einheiten bestehen. Bei Nukleinsäuren ist die sich wiederholende Einheit das Nukleotid. Ein Nukleotid besteht aus einem Zucker mit fünf Kohlenstoffatomen, einer stickstoffhaltigen Base und einer Phosphatgruppe. Die beiden Hauptarten von Nukleinsäuren, die Desoxyribonukleinsäure (DNA) und die Ribonukleinsäure (RNA), besitzen leicht unterschiedliche Zucker in ihren jeweiligen Nukleotiden und einen unterschiedlichen Satz von vier Basen, die in ihren Nukleotiden enthalten sein können.
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| DNA Nukleotid | |
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| RNA-Nukleotid | Die Struktur eines Abschnitts eines RNA-Moleküls. |
Beachte das Vorhandensein einer Hydroxylgruppe am 2′-Kohlenstoff des Zuckers Moety.
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| Adenin – DNA und RNA |
Guanin – DNA und RNA |
Thymin –
DNA und RNA |
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| Cytosin – DNA und RNA |
Uracil – Nur RNA |
Von großer Bedeutung für die Elektrophorese ist die Ionisierung der Phosphatgruppen, Sie verleiht den Nukleinsäuren eine große negative Nettoladung. Da jedes Nukleotid ionisiert ist, stimmt das Verhältnis von Ladung zu Masse zweier verschiedener Nukleinsäuremoleküle sehr gut überein.
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| Die Phosphatgruppen jedes Nukleotids tragen eine negative formale Ladung. Da jedes Nukleotid die gleiche Ladung trägt, ist das Verhältnis von Ladung zu Masse verschiedener Nukleinsäuremoleküle nahezu identisch. Die elektrische Kraft bewirkt, dass negativ geladene Nukleinsäuremoleküle in Richtung des positiven Pols wandern. | |
DNA und RNA enthalten jeweils vier mögliche Nukleotide, die dem Satz von vier möglichen Basen entsprechen (Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin für die DNA; Adenin, Guanin, Uracil und Cytosin für RNA). Jede Base weist aufgrund von Wasserstoffbrückenbindungen eine besondere Affinität zu einer der drei anderen Basen auf. Die Stickstoffbase Adenin bildet ein „Basenpaar“ mit Thymin (oder Uracil in der RNA). Guanin bildet eine „Basenpaarung“ mit Cytosin. Aufgrund der Basenpaarung können DNA oder RNA als einzelsträngige oder doppelsträngige Varianten vorliegen. Die doppelsträngige Form besteht aus zwei komplementären Strängen, die durch Basenpaarung verbunden sind.
Durch die Basenpaarung zweier komplementärer Stränge können Nukleinsäuremoleküle eine doppelsträngige Form annehmen.
Basenpaarung kann auch bei einzelsträngiger DNA oder RNA auftreten. Ein Abschnitt, der eine Sequenz von Nukleotiden enthält, wird oft zurückgeschleift und mit einem komplementären Abschnitt auf derselben Kette eine Basenpaarung eingehen. Dies wirkt sich auf die dreidimensionale Struktur des Moleküls aus, was wiederum Auswirkungen auf elektrophoretische Trennungen hat. Im Allgemeinen liegen lange DNA- oder RNA-Stränge in einer basengepaarten Konformation vor, entweder doppelsträngig oder einzelsträngig mit interner Paarung. Ungepaarte oder „denaturierte“ Nukleinsäuren findet man in Lösung nur unter speziellen Bedingungen, die die Basenpaare destabilisieren.
Basenpaarung ist nicht auf doppelsträngige Varianten beschränkt, sondern kann auch innerhalb desselben Moleküls auftreten. Die daraus resultierenden Konformationen können zu schwer zu interpretierenden Elektrophoreseergebnissen führen.
Die Elektrophorese von doppelsträngiger DNA oder RNA wird als native Gelelektrophorese bezeichnet. Die Elektrophorese von einzelsträngiger DNA oder RNA erfolgt unter denaturierenden Bedingungen. Formamid und Harnstoff sind die beiden gebräuchlichsten Mittel, die eine chemische Denaturierung bewirken. Diese Substanzen unterbrechen die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Stickstoffbasen und heben so die Auswirkungen der Basenpaarung auf. In der Regel wird während des gesamten Prozesses der denaturierenden Elektrophorese, von der Probenvorbereitung bis zum Lauf des Gels, eine Kombination aus Formamid, Harnstoff und Wärme eingesetzt. Der Zweck der Denaturierungsbedingungen besteht darin, einzelsträngige Moleküle zu gewährleisten und Konformationsänderungen aufgrund von Basenpaarungen zwischen verschiedenen Abschnitten desselben DNA- oder RNA-Moleküls zu verhindern. Denaturierende Elektrophoresebedingungen ermöglichen ein konsistentes Verhältnis zwischen Molekülgröße und Mobilität durch das Gel.
Formamid und Harnstoff bewirken die Denaturierung von DNA oder RNA, indem sie neue Wasserstoffbrückenbindungen mit den Basen der Nukleinsäuremoleküle bilden und die Wasserstoffbrückenbindungen, die zur Basenpaarung führen, unterbrechen.
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