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Probenanforderungen und Verfahren

ELISAs werden in Polystyrolplatten durchgeführt, typischerweise in 96-Well-Platten, die beschichtet sind, um Proteine sehr stark zu binden. Je nach ELISA-Typ erfordert der Test einen primären und/oder sekundären Nachweisantikörper, Analyt/Antigen, Beschichtungsantikörper/Antigen, Puffer, Waschlösung und Substrat/Chromogen. Der primäre Detektionsantikörper ist ein spezifischer Antikörper, der nur an das interessierende Protein bindet, während ein sekundärer Detektionsantikörper ein zweiter enzymkonjugierter Antikörper ist, der einen primären Antikörper bindet, der nicht enzymkonjugiert ist.

Es gibt vier allgemeine Hauptschritte zur Durchführung eines ELISA-Immunoassays. Diese Schritte sind:

1. Beschichtung (entweder mit Antigen oder mit Antikörper)
2. Blockierung (in der Regel durch Zugabe von Rinderserumalbumin)
3. Detektion
4. Endablesung

Die Detektion erfolgt durch Zugabe eines Substrats, das eine Farbe erzeugen kann. Es gibt viele Substrate, die für den ELISA-Nachweis verwendet werden können. Die am häufigsten verwendeten sind jedoch Meerrettichperoxidase (HRP) und alkalische Phosphatase (ALP). Das Substrat für HRP ist Wasserstoffperoxid und führt zu einem blauen Farbumschlag. ALP misst die gelbe Farbe von Nitrophenol nach 15- bis 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur und verwendet in der Regel P-Nitrophenylphosphat (pNPP) als Substrat.

Zwischen den vier oben genannten Schritten wird die Platte mit einem Puffer, z. B. phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und einem nichtionischen Detergens, gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. Die Vertiefungen werden je nach spezifischem Protokoll zwei- oder mehrmals gewaschen.

Im ELISA-Protokoll wird normalerweise eine serielle Verdünnung der Konzentrationen in die Vertiefungen der Platte gegeben. Nach der Messung der Ergebnisse wird eine Standardkurve aus den Daten der seriellen Verdünnungen erstellt, wobei die Konzentration auf der x-Achse mit einer logarithmischen Skala und die Absorption auf der y-Achse mit einer linearen Skala dargestellt wird.

Es gibt vier Haupttypen von ELISA:

• Direkter ELISA (antigenbeschichtete Platte; Screening-Antikörper)
• Indirekter ELISA (antigenbeschichtete Platte; Screening-Antigen/Antikörper)
• Sandwich ELISA (antikörperbeschichtete Platte; Screening-Antigen)
• Kompetitiver ELISA (Screening-Antikörper)

Direkter ELISA

Sowohl der direkte als auch der indirekte ELISA beginnen mit dem Auftragen von Antigen auf die ELISA-Platten. Der erste Bindungsschritt beinhaltet die Zugabe von Antigen auf die Platten, die dann eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius oder über Nacht bei 4 Grad Celsius inkubiert werden. Nach Abschluss der Inkubation werden die Platten von potenziell ungebundenen Antikörpern gewaschen und alle ungebundenen Stellen auf der ELISA-Platte mit Mitteln wie BSA, Ovalbumin, Aprotinin oder anderen tierischen Proteinen blockiert. Dieser zweite Schritt ist wichtig, weil er die Bindung von unspezifischen Antikörpern an die Platte verhindert und falsch-positive Ergebnisse minimiert. Nach Zugabe des Puffers wird die Platte erneut gewaschen und ein ausgewählter enzymkonjugierter primärer Nachweisantikörper zugegeben. Die Platte wird eine Stunde lang weiter inkubiert.

Bei einem direkten ELISA bindet der primäre Nachweisantikörper direkt an das gewünschte Protein. Danach wird die Platte erneut gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen, und anschließend wird ein Substrat/Chromophor wie alkalische Phosphatase (AP) oder Meerrettich-Peroxidase (HRP) auf die Platte gegeben, was zu einem Farbwechsel führt. Die Farbänderung der Probe erfolgt entweder durch die Hydrolyse der Phosphatgruppen des Substrats durch AP oder durch die Oxidation der Substrate durch HRP. Zu den Vorteilen des direkten ELISA gehört, dass die Kreuzreaktivität der sekundären Antikörper entfällt und dass er im Vergleich zum indirekten ELISA aufgrund der geringeren Anzahl von Schritten schneller ist. Zu den Nachteilen gehören die geringe Empfindlichkeit im Vergleich zu den anderen ELISA-Typen und die hohen Reaktionskosten.

Indirekter ELISA

Die Schritte des indirekten ELISA sind identisch mit dem direkten ELISA, mit Ausnahme eines zusätzlichen Waschschritts und der Antikörpertypen, die nach dem Entfernen des Puffers hinzugefügt werden. Für den indirekten ELISA werden zwei Antikörper benötigt: ein primärer Nachweisantikörper, der an das betreffende Protein bindet, und ein sekundärer, enzymgekoppelter Antikörper, der komplementär zum primären Antikörper ist. Der primäre Antikörper wird zuerst zugegeben, dann folgt ein Waschschritt, und anschließend wird der enzymkonjugierte sekundäre Antikörper zugegeben und inkubiert. Danach folgen die gleichen Schritte wie beim direkten ELISA, d. h. ein Waschschritt, die Zugabe von Substrat und der Nachweis einer Farbveränderung.

Der indirekte ELISA hat im Vergleich zum direkten ELISA eine höhere Empfindlichkeit. Außerdem ist er kostengünstiger und flexibler, da viele verschiedene Primärantikörper verwendet werden können. Der einzige große Nachteil dieses ELISA-Typs ist das Risiko einer Kreuzreaktivität zwischen den sekundären Nachweisantikörpern.

Sandwich-ELISA

Im Gegensatz zum direkten und indirekten ELISA wird beim Sandwich-ELISA zunächst ein Fängerantikörper auf die Vertiefungen der Platte aufgetragen. Er wird als „Sandwich“ bezeichnet, weil die Antigene zwischen zwei Schichten von Antikörpern (Fänger- und Nachweisantikörper) eingebettet sind. Nach dem Auftragen des Fängerantikörpers werden die Platten abgedeckt und über Nacht bei 4 °C bebrütet. Nach Abschluss des Beschichtungsvorgangs werden die Platten mit PBS gewaschen und anschließend mit BSA gepuffert/blockiert. Die Pufferwäschen werden mindestens 1-2 Stunden lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Schließlich wird die Platte vor der Zugabe des Antigens noch einmal mit PBS gewaschen.

Das Antigen von Interesse wird dann zu den Platten gegeben, damit es an den Fänger-Antikörper bindet, und 90 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Platte wird erneut gewaschen, und der primäre Nachweisantikörper wird dann zu der Platte gegeben und weitere 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einem Pufferwaschgang. Dann wird der sekundäre enzymkonjugierte Antikörper zugegeben und für weitere 1 bis 2 Stunden inkubiert. Die Platte wird erneut gewaschen, und das Substrat wird zugegeben, um einen Farbwechsel zu bewirken. Der Sandwich-ELISA hat die höchste Empfindlichkeit unter allen ELISA-Typen. Die größten Nachteile dieses ELISA-Typs sind der hohe Zeit- und Kostenaufwand und die notwendige Verwendung von „matched pair“ (divalentes/multivalentes Antigen) und sekundären Antikörpern.

Kompetitiver ELISA

Der kompetitive ELISA testet auf das Vorhandensein eines für Antigene spezifischen Antikörpers im Testserum. Bei dieser Art von ELISA werden zwei spezifische Antikörper verwendet, ein enzymkonjugierter Antikörper und ein weiterer Antikörper, der im Testserum vorhanden ist (wenn das Serum positiv ist). Durch die Kombination der beiden Antikörper in den Vertiefungen wird ein Wettbewerb um die Bindung an das Antigen ausgelöst. Das Vorhandensein einer Farbveränderung bedeutet, dass der Test negativ ist, da der enzymkonjugierte Antikörper die Antigene (nicht die Antikörper des Testserums) gebunden hat. Das Ausbleiben der Farbe bedeutet einen positiven Test und das Vorhandensein von Antikörpern im Testserum. Der kompetitive ELISA hat eine geringe Spezifität und kann nicht bei verdünnten Proben eingesetzt werden. Die Vorteile liegen jedoch darin, dass weniger Probenaufreinigung erforderlich ist, eine große Anzahl von Antigenen in einer gegebenen Probe gemessen werden kann, für kleine Antigene verwendet werden kann und eine geringe Variabilität aufweist.