Degenerierte Codon-Mischung für PCR-basierte Manipulation hoch repetitiver Sequenzen

Ergebnisse und Diskussion

Der in Jiang et al. beschriebene „Autophagic Flux“-Assay ist ein quantitativer Reporter-Assay mit grün fluoreszierendem Protein (GFP), der die ratiometrischen Veränderungen von polyQ-GFP zu freiem GFP mittels Western Blot-Analyse misst. Es wurde ein multicistronisches Reporter-Konstrukt entwickelt, das für zwei Proteine kodiert: polyQ, das mit N-terminalem GFP verbunden ist, und freies GFP. Die virale 2A-Sequenz (v2A) wurde als Linker-Region zwischen den für die beiden Proteine kodierenden Sequenzen platziert, um die stöchiometrische Translation zweier separater Proteine aus einem offenen Leseraster zu ermöglichen (Abb. 1a).

Wir haben eine polyQ-Sequenz mit 80 Glutamin-Wiederholungen (Q80) entworfen. Die Sequenz wurde so entworfen, dass sie eine geringe Wiederholungsähnlichkeit aufweist, indem Glutamin-kodierende CAG-Tripletts mit Glutamin-kodierenden CAA-Tripletts zufällig durchsetzt wurden (Abb. 1b, c). Die Nukleotidsubstitutionen wurden nach Augenmaß vorgenommen, um ein halbzufälliges Muster zu erzeugen. Dieses nicht-repetitive Sequenzdesign sollte nicht nur die Sequenzstabilität während der Vermehrung in Bakterien erhöhen, sondern ermöglichte auch das Design von PCR-Primern, die an spezifische Regionen der Sequenz annektieren.

Das oben beschriebene Q80-GFP-v2A-GFP-Konstrukt wurde kommerziell synthetisiert (Biomatik Corporation) (siehe Zusatzdatei 1) und über die BamHI- und ClaI-Restriktionsstellen in den auf dem Tol2-Transposon basierenden Gentransfervektor pT2AL200R150G (im Folgenden als Tol2 bezeichnet) aus dem Kawakami-Laboratorium subkloniert (Abb. 1a und siehe Zusatzdatei 2).

PolyQ-Konstrukte mit einer geringeren Anzahl von Glutaminwiederholungen wurden durch PCR-basierte Ausschlussamplifikation des Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP-Konstrukts erzeugt. Die Primer wurden so konzipiert, dass sie um den Vektor herum amplifizieren und eine bestimmte Anzahl von Glutamin-Wiederholungen ausschließen, um die gewünschten Konstrukte zu erzeugen (Abb. 1d-f). Unser Ziel war es, Vektoren mit etwa 52 (Q52), 31 (Q31) und 10 (Q10) Glutamin-Wiederholungen zu erzeugen. Die mutmaßlichen Q52- und Q31-Vektoren wurden mit demselben Rückwärtsprimer in Verbindung mit verschiedenen Vorwärtsprimern erzeugt. Dieser gemeinsame Rückwärtsprimer amplifizierte 2 Glutamin-Wiederholungen, während die Vorwärtsprimer die zusätzlichen 50 bzw. 29 Glutamin-Wiederholungen amplifizierten, die zur Erzeugung der Q52- bzw. Q31-Vektoren benötigt wurden. Die Position des Rückwärtsprimers wurde leicht verschoben, um die Amplifikation des mutmaßlichen Q10-Vektors zu optimieren, so dass der Rückwärtsprimer nun 5 Glutamin-Wiederholungen amplifizierte, während der Vorwärtsprimer die restlichen 5 Glutamin-Wiederholungen amplifizierte (Abb. 1d-f). Durch die Verwendung strenger Annealing-Temperaturen in der PCR-Reaktion erreichten wir eine spezifische Primerbindung. Die aus dem Gel extrahierten und gereinigten PCR-Produkte wurden phosphoryliert, durch Selbstligation zirkularisiert und anschließend in kompetente Zellen transformiert (siehe Additional file 3). Die PCR mit Primern, die die polyQ-Region flankierten, ergab annähernd die erwarteten Produktgrößen für die vorgesehenen putativen Q52-, Q31- und Q10-Vektoren (Abb. 1g). Die erzeugten Konstrukte wurden sequenziert, um festzustellen, ob die erwarteten polyQ-Wiederholungszahlen vorhanden waren. Während das Q52-Konstrukt die erwartete Anzahl von Glutamin-Wiederholungen aufwies (Abb. 2a, b), ergab die Sequenzierung geringfügige Abweichungen von der erwarteten PolyQ-Anzahl für die beiden anderen Konstrukte, wobei der Tol2-Q31-GFP-v2A-GFP-Vektor 21 Glutamin-Wiederholungen aufwies (im Folgenden als Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP bezeichnet) (Abb. 2c, d) und der Tol2-Q10-GFP-v2A-GFP-Vektor hatte 11-Glutamin-Wiederholungen (im Folgenden Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP genannt) (Abb. 2e, f). Weitere Analysen ergaben, dass die erzeugte Q21-Sequenz direkt von der ursprünglichen Sequenz abgeleitet war und der Verlust der Glutamin-Wiederholungen darauf zurückzuführen war, dass der Q31-Vorwärtsprimer 30 bp stromabwärts von der vorhergesagten Bindungsstelle bindet. Im Gegensatz dazu wurde die zusätzliche Glutaminwiederholung in der Q11-Sequenz de novo generiert, durch Hinzufügen eines CAA-Codons.

Um die Aggregationskinetik und den „autophagischen Fluss“ des polyQ-Proteins in vivo zu untersuchen, injizierten wir die erzeugten polyQ-Vektoren (25 ng/μL) und Transposase-mRNA (25 ng/μL) in Gruppen von Zebrafischembryonen im Ein-Zell-Stadium (Abb. 3a, b). Für jede Gruppe wurde eine Western-Blot-Analyse mit Anti-GFP-Antikörpern von 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) hergestellten Embryo-Lysaten (10 Embryonen pro Probe) durchgeführt. Der leere Tol2-Vektor (25 ng/μL) und Transposase-mRNA (25 ng/μL) injizierte und nicht injizierte Embryonen dienten als Kontrollen. Embryonen, denen die polyQ-Konstrukte injiziert wurden, produzierten erwartungsgemäß zwei Banden, die mit dem Anti-GFP-Antikörper nachgewiesen wurden: GFP, das an polyQ gebunden ist (polyQ80-GFP mit ~ 48 kDa, polyQ52-GFP mit ~ 38 kDa, polyQ21-GFP mit ~ 33 kDa und polyQ11-GFP mit ~ 31 kDa), und freies GFP (~ 27 kDa) (Abb. 3c). Jedes der polyQ-GFP-Konstrukte, die Embryo-Lysate exprimieren, zeigte auch eine schwächere Bande mit höherer Proteingröße, die dem polyQX-GFP-v2A-GFP-Konstrukt in voller Länge entspricht (polyQ80-GFP-v2A-GFP mit ~ 75 kDa, polyQ52-GFP-v2A-GFP mit ~ 65 kDa, polyQ21-GFP-v2A-GFP mit ~ 60 kDa und polyQ11-GFP-v2A-GFP mit ~ 58 kDa). Diese Bande entspricht etwa 10 % des Gesamtproteins, das bei Verwendung des v2A-Sequenzsystems als einzelnes Protein in voller Länge übersetzt wird. Die Verhältnisse von Q80-GFP:GFP, Q52-GFP:GFP, Q21-GFP:GFP und Q11-GFP:GFP betragen ~ 5, ~ 4, ~ 2 bzw. ~ 1 (Abb. 3d). Da die v2A-Sequenz die stöchiometrische Translation der polyQ-GFP- und GFP-Proteine ermöglicht, sollte das polyQ-GFP:GFP-Verhältnis theoretisch 1 sein. Die beobachteten größeren Verhältnisse könnten auf eine Akkumulation dieser Proteine hinweisen. Diese Beobachtungen stimmen mit der Literatur überein, in der gezeigt wurde, dass polyQ-GFP-Fusionskonstrukte, die mehr als 19 Glutaminreste enthalten, in transfizierten Zellen in Abhängigkeit von der Länge aggregieren. Diese Beobachtungen lassen uns zu dem Schluss kommen, dass unsere Tol2-QX-GFP-v2A-GFP-Konstrukte ein nützliches Instrument zur Untersuchung des „autophagischen Flusses“ in vivo in einem larvalen Zebrafischmodell darstellen.

Schlussfolgerung

Zusammenfassend bietet diese Studie eine robuste und leicht anwendbare Lösung zur Erzeugung von PolyQ-Wiederholungen in der Nähe der beabsichtigten Länge. Um eine exakte Anzahl von Glutamin-Wiederholungen zu erzeugen, können nachfolgende Amplifikationsrunden mit geänderten Primer-Sequenzen durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die Primerlänge erhöht werden, um die Spezifität der Primeranlagerung an die Vorlage zu verbessern. Unsere Technik hat mehrere Vorteile gegenüber den bestehenden Methoden für die PCR-basierte Amplifikation repetitiver Regionen und zielt darauf ab, die Erzeugung unspezifischer PCR-Produkte und fehlerhafter Wiederholungen zu minimieren, indem die Codon-Redundanz des genetischen Codes ausgenutzt wird, um eine synonyme DNA-Codierungssequenz mit reduzierter Wiederholung zu erzeugen. Darüber hinaus ist unser Ansatz nicht auf die Erzeugung von polyQ-Wiederholungssequenzen beschränkt, sondern kann auch für die Erzeugung anderer Nukleotid-Wiederholungssequenzen verallgemeinert werden. Darüber hinaus ist unsere Methode relativ kostengünstig, da nur das anfängliche polyQ80-GFP-v2A-GFP-Konstrukt eine kommerzielle Synthese erfordert, deren Kosten vom Preis pro Nukleotidbase, Länge, Reinheit und Masse abhängen. Alle anderen benötigten Materialien sind Standardreagenzien für die molekulare Klonierung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beschriebene Technik eine einfach zu handhabende, erschwingliche Lösung für die Erzeugung von wiederholt kodierenden DNA-Sequenzen darstellt, die nach Bedarf manipuliert werden können.