Endotoxin-Nachweis – von Limulus-Amöbozyten-Lysat zu rekombinantem Faktor C

Gram-negatives bakterielles Endotoxin ist ein biologisches Pyrogen, das bei intravenöser Verabreichung Fieber verursacht. Das Endotoxin, das auch als Lipopolysaccharid (LPS) bezeichnet wird, befindet sich in der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien. Bei einer gramnegativen Sepsis stimuliert das Endotoxin die Makrophagen des Wirts zur Freisetzung von Entzündungszytokinen. Eine übermäßige Entzündung führt jedoch zum Versagen mehrerer Organe und zum Tod. Endotoxine, die allgegenwärtige pathogene Moleküle sind, sind ein Fluch für die pharmazeutische Industrie und das Gesundheitswesen. Daher ist ein frühzeitiger und empfindlicher Nachweis von Endotoxinen von entscheidender Bedeutung, um eine Endotoxämie zu verhindern. Das Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL) wird seit etwa 30 Jahren für den Nachweis von Endotoxin bei der Qualitätssicherung von injizierbaren Arzneimitteln und Medizinprodukten eingesetzt. Das LAL bildet eine Kaskade von Serinproteasen, die durch Spuren von Endotoxin ausgelöst werden und am Ende der Reaktion zu einem Gelgerinnsel führen. Der Faktor C, der normalerweise als Zymogen vorliegt, ist der Primer dieser Gerinnungskaskade. In vivo ist der Faktor C der perfekte Biosensor, der den Hufeisenkrebs auf die Anwesenheit eines gramnegativen Eindringlings aufmerksam macht. Der hämostatische Endpunkt schließt den Eindringling ein, tötet ihn ab und begrenzt eine weitere Infektion. Als Instrument zum In-vitro-Nachweis von Endotoxinen stellen jedoch Schwankungen in der Empfindlichkeit und Spezifität von LAL für Endotoxine sowie der schwindende Vorrat an Hufeisenkrebsen die Biotechnologiebranche vor immer größere Herausforderungen. Dies machte die Entwicklung eines alternativen Tests für Endotoxin erforderlich. So wurde Faktor C zum offensichtlichen, wenn auch heiklen Ziel für die Bemühungen um rekombinante Technologien. Dieses Kapitel dokumentiert den Weg von der Gewinnung des natürlichen Blutlysats der gefährdeten Spezies bis hin zu den monumentalen Anstrengungen der Gentechnik, um rekombinanten Faktor C (rFC) herzustellen. Der rFC ist ein 132 kDa-Molekül, das als Proenzym produziert wurde, das durch die Anwesenheit von Spuren von Endotoxin induziert werden kann. Die rFC bildet die Grundlage des „PyroGene“-Kits, eines neuartigen mikro-enzymatischen Endotoxin-Diagnosetests für Hochdurchsatz-Screens von Endotoxin. Unter Verwendung der rFC hat Lonza Inc. die „PyroSense“ entwickelt, die als Kontrollpunkte in der biotechnologischen Produktionslinie dient. Vom Klonen bis hin zu kommerziellen Anwendungen hat die rFC eine neue Ära der Endotoxin-Tests für die Qualitätssicherung biomedizinischer Produkte und für die Gesundheitsindustrie eingeleitet und dabei die gefährdeten Hufeisenkrebse verschont.