Extrinsische versus intrinsische Apoptosewege in der Krebschemotherapie

Signaling durch den intrinsischen Weg der Apoptose

Im mitochondrialen Weg der Apoptose, ist die Caspase-Aktivierung eng mit der Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran durch proapoptotische Mitglieder der Bcl-Familie verbunden (Green und Kroemer, 2004). Zahlreiche zytotoxische Stimuli und proapoptotische signalübertragende Moleküle wirken auf Mitochondrien ein, um eine Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran zu bewirken (Decaudin et al., 1998; Green und Kroemer, 2004). Diese Permeabilisierung wird durch Proteine der Bcl-2-Familie, mitochondriale Lipide, Proteine, die den bioenergetischen Metabolitenfluss regulieren, und Komponenten der Permeabilitätsübergangspore gesteuert (Green und Kroemer, 2004). Bei der Zerstörung der äußeren Mitochondrienmembran wird eine Reihe von Proteinen freigesetzt, die sich normalerweise im Raum zwischen der inneren und äußeren Mitochondrienmembran befinden, darunter Cytochrom c, Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, AIF und Endonuklease G (Saelens et al., 2004). Einmal im Zytosol, lösen diese apoptogenen Proteine den Zelltod aus, indem sie die Caspase-Aktivierung fördern oder als Caspase-unabhängige Todeseffektoren wirken (Saelens et al, 2004).

Mitochondriale Mediatoren der Caspase-abhängigen Apoptose

Cytochrom c

Die Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien löst direkt die Aktivierung von Caspase-3 durch die Bildung des Cytochrom c/Apaf-1/Caspase-9 enthaltenden Apoptosom-Komplexes aus (Cain et al., 2000). Im Zytosol bindet Cytochrom c an die C-terminale Region von Apaf-1, einem zytosolischen Protein mit einer N-terminalen Caspase-Rekrutierungsdomäne (CARD), einer Nukleotid-Bindungsdomäne mit Homologie zu CED-4 von Caenorhabditis elegans und einer C-terminalen Domäne mit 12-13 WD-40-Wiederholungen (Zou et al., 1997). Die Bindung von Cytochrom c an Apaf-1 erleichtert die Assoziation von dATP mit Apaf-1 und legt dessen N-terminale CARD frei, die nun oligomerisieren und zu einer Plattform werden kann, auf der die Initiator-Caspase-9 rekrutiert und durch eine CARD-CARD-Interaktion aktiviert wird (Adrain et al., 1999). Anschließend wird die Ausführungs-Caspase-3 zum Apoptosom rekrutiert, wo sie von der dort ansässigen Caspase-9 aktiviert wird (Bratton et al., 2001). Caspase-3 spaltet dann Schlüsselsubstrate in der Zelle, um viele der zellulären und biochemischen Vorgänge der Apoptose auszulösen.

In bestimmten Fällen trägt die durch cytosolisches Cytochrom c ausgelöste Caspase-Aktivität zum Abfall der Matrix-Metalloproteinase (MMP) bei, wie durch die Verwendung synthetischer Caspase-Inhibitoren und Apaf1 -/- Zellen gezeigt wurde (Waterhouse et al., 2001). Darüber hinaus schädigt die Caspase-Aktivität die Funktion der permeabilisierten Mitochondrien weiter, indem sie die Aktivität der Komplexe I und II beeinträchtigt, was unweigerlich zum Verlust von MMP und zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies führt (Ricci et al., 2004). Somit können sekundäre Ereignisse, die sich aus zytosolischen Veränderungen ergeben und durch die Freisetzung von Cytochrom c und anderen mitochondrialen IMS-Proteinen verursacht werden, auf permeabilisierte Mitochondrien zurückwirken und deren Funktion beeinträchtigen. Wichtig ist, dass diese mitochondriale Verstärkungsschleife der Caspase-Aktivität die Reaktion von Krebszellen auf zytotoxische Behandlungen entscheidend bestimmen kann.

Außerdem gibt es neuerdings Hinweise auf die Existenz eines Cytochrom-c- und Apoptosomen-unabhängigen, aber Apaf-1-abhängigen Mechanismus(en) für die Caspase-Aktivierung. Durch gezieltes Knock-in einer Variante von Cytochrom c, die keine apoptogenen Eigenschaften besitzt, aber Elektronentransfer und antioxidative Aktivität aufweist (K72A), konnte der Beitrag von Cytochrom c zur Apoptose untersucht werden, ohne dass seine Funktion bei der oxidativen Phosphorylierung beeinträchtigt wurde (Hao et al., 2005). Interessanterweise reagierten Thymozyten aus KA/KA-Mäusen deutlich empfindlicher auf Todesstimuli wie Etoposid und γ-Bestrahlung als Apaf-1(-/-)-Thymozyten (Hao et al., 2005). Nach einer Behandlung mit γ-Bestrahlung wurden die Procaspasen in apoptotischen KA/KA-Thymozyten effizient aktiviert, eine Apaf-1-Oligomerisierung wurde jedoch nicht beobachtet (Hao et al., (Hao et al., 2005), was darauf hindeutet, dass Cytochrom c und Apaf-1 in der Apoptose eine unterschiedliche Rolle spielen.

Smac/DIABLO

Andere Proteine, die aus Mitochondrien freigesetzt werden, wie Smac/DIABLO und Omi/HtrA2, erleichtern die Caspase-Aktivierung, indem sie endogene Caspase-Inhibitoren, die Inhibitor of Apoptosis Proteins (IAPs), neutralisieren. Smac und sein murines Homolog DIABLO sind kernkodierte mitochondriale Proteine, die ein mitochondriales Lokalisierungssignal enthalten, das beim mitochondrialen Import proteolytisch entfernt wird, um das reife 23 kDa-Protein zu erhalten (Du et al., 2000; Verhagen et al., 2000). Dieser Reifungsschritt legt das IAP-Bindungsmotiv (IBM) am N-Terminus von Smac/DIABLO frei (Du et al., 2000) (Tabelle 1). Es wurde gezeigt, dass der zweite aus Mitochondrien stammende Caspase-Aktivator/DIABLO an XIAP, cIAP1, cIAP2, Survivin und Apollon auf BIR-abhängige Weise bindet (Vaux und Silke, 2003) (Abbildung 2) und als Homodimer wirkt, wobei das IBM in einer bivalenten Konfiguration vorliegt (Chai et al., 2000). Ein Smac/DIABLO-Dimer bindet ein XIAP-Molekül über beide IAP-Bindungsmotive, wobei eines mit BIR2 und das andere mit BIR3 interagiert (Huang et al., 2003). Interessanterweise bindet dieselbe BIR3-Rille das am N-Terminus (Ala-Thr-Pro-Phe) der kleinen Untereinheit von Caspase-9 nach deren autokatalytischer Prozessierung nach Asp315 exponierte IBM, wodurch Smac/DIABLO Caspase-9 von XIAP verdrängen kann (Srinivasula et al., 2001) (Tabelle 1).

Die physiologische mitochondriale Funktion von Smac/DIABLO ist unbekannt, und DIABLO -/- Mäuse scheinen normal zu sein (Okada et al., 2002). Obwohl die in vitro-Spaltung von Procaspase-3 nach Zugabe von Cytochrom c in Lysaten von Smac -/- Zellen gehemmt war, reagierten Smac -/- Mäuse und Zellen normal auf apoptotische Reize wie UV-Bestrahlung, Staurosporin, Etoposid und TNF/Cyclohexamid (Okada et al., 2002). Diese Beobachtungen deuten auf die Existenz redundanter Faktoren hin, die den Verlust von Smac/DIABLO kompensieren, möglicherweise HtrA2/OMI.

Omi/HtrA2 ist ein kernkodiertes 49 kDa Protein mit einem N-terminalen mitochondrialen Lokalisierungssignal, das seine Translokation in den mitochondrialen Intermembranraum vermittelt (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). Omi/HtrA2 wird im Intermembranraum zur 37 kDa reifen Form prozessiert, wobei an seinem N-Terminus ein IBM freigesetzt wird (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002) (Tabelle 1). Obwohl rekombinantes Omi/HtrA2 seine eigene Reifung in vitro katalysieren kann, ist die Protease, die für seine Reifung in Zellen verantwortlich ist, noch unbekannt (Martins et al., 2002). Omi/HtrA2 spielt eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der mitochondrialen Homöostase, die seine proteolytische Aktivität erfordert, obwohl die molekularen Ziele und Interaktionspartner von Omi/HtrA2 im Mitochondrium noch nicht definiert sind (Saelens et al., 2004). Sobald Omi/HtrA2 aus den Mitochondrien in das Zytosol freigesetzt wird, fördert es den Zelltod auf eine Caspase-abhängige Weise, indem es IAPs antagonisiert, und auf eine Caspase-unabhängige Weise als Protease (Saelens et al., 2004). Ähnlich wie Smac/DIABLO blockiert Omi/HtrA2 IAPs durch sein N-terminales IAP-bindendes Motiv, das in einer trimeren Konfiguration vorliegt (Li et al, 2002)

Obwohl die Freisetzung von Cytochrom c in das Zytosol direkt die Aktivierung von Caspase-3 durch die Bildung des Cytochrom c/Apaf-1/Caspase-9 enthaltenden Apoptosom-Komplexes auslöst, fördern Smac/DIABLO und Omi/HtrA2 indirekt die Caspase-Aktivierung, indem sie die hemmenden Wirkungen auf IAPs antagonisieren (Saelens et al., 2004). Es besteht also ein dynamisches Gleichgewicht zwischen pro- und antiapoptotischen Effektormolekülen, das es der Zelle ermöglicht, mit einer begrenzten mitochondrialen Schädigung fertig zu werden, wobei IAPs die durch eine geringe Menge freigesetzten Cytochroms ausgelöste Caspase-Aktivierung angemessen blockieren können. Wenn jedoch die mitochondriale Schädigung fortschreitet oder mehrere Mitochondrien gleichzeitig betroffen sind, kann die von den IAPs aufgestellte antiapoptotische Hürde durch die höhere zytosolische Konzentration ihrer Antagonisten Smac/DIABLO und HtrA2/OMI überwunden werden, die die IAPs durch direkte Bindung neutralisieren.

Es gibt immer mehr Beweise dafür, dass Krebszellen einen intrinsischen Antrieb zur Apoptose haben, der von den IAPs in Schach gehalten wird. Zu diesem Zweck wurden in verschiedenen Tumorzelllinien und Krebsgeweben, nicht aber in normalen Zellen, hohe Basalwerte der Caspase-3- und Caspase-8-Aktivitäten und aktive Caspase-3-Fragmente bei fehlender Apoptose nachgewiesen (Yang et al., 2003a). Tumorzellen, nicht aber normale Zellen, exprimierten auch hohe Mengen an IAPs, was darauf hindeutet, dass die hochregulierte IAP-Expression der hohen basalen Caspase-Aktivität in Tumorzellen selektiv entgegenwirkt (Yang et al., 2003a). Daher gelten Strategien, die auf IAPs abzielen, als vielversprechender Ansatz, um die Wirksamkeit zytotoxischer Therapien selektiv in Krebszellen zu erhöhen. Zu diesem Zweck senkte die durch Transfektion verstärkte Expression von Smac/DIABLO den Schwellenwert für die TRAIL-induzierte Abtötung in verschiedenen Tumoren (Ng und Bonavida, 2002; Okano et al., 2003) und sensibilisierte Krebszellen für Chemotherapie (McNeish et al., 2003; Zhao et al., 2006). Allerdings scheint die Translokation von endogenem Smac/DIABLO in das Zytosol während der durch Krebsmedikamente ausgelösten Apoptose unter bestimmten Bedingungen keine große Rolle zu spielen, z. B. bei menschlichen Lungenkarzinomzellen nach Behandlung mit Etoposid (Bartling et al., 2004). Die Herunterregulierung von Smac/DIABLO durch kleine interferierende RNA (siRNA) hatte keinen Einfluss auf die Abtötung durch Etoposid in diesen Zellen, obwohl ein IAP-bindendes Peptid Smac-N7 die Etoposid-induzierte Apoptose verstärkte (Bartling et al., 2004). Diese Daten deuten darauf hin, dass ein Smac/DIABLO-Mangel durch die Wirkung redundanter Determinanten in bestimmten Krebszellen kompensiert werden kann.

Mitochondriale Mediatoren der Caspase-unabhängigen Apoptose

Nach seiner Freisetzung aus dem mitochondrialen Intermembranraum trägt HtrA2/OMI zum Zelltod auch auf eine Caspase-unabhängige Weise als Protease bei, zusätzlich zur Förderung der Apoptose auf eine Caspase-abhängige Weise durch Antagonisierung von IAPs (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). In vitro-Daten zeigten den Abbau von XIAP, cIAP1, cIAP2 und Apollon durch die Proteaseaktivität von HtrA2/OMI (Suzuki et al., 2004). Darüber hinaus wiesen Trencia et al. (2004) die Interaktion des antiapoptotischen PED/PEA-15 mit dem zytosolischen HtrA2/OMI und dessen Abbau durch dieses nach. Die Verringerung des HtrA2/OMI-Spiegels in Zellen durch Antisense- oder RNA-Interferenz senkt die Empfindlichkeit verschiedener Krebszelllinien gegenüber dem durch Staurosporin, Fas, UV oder Cisplatin induzierten Zelltod (Martins et al., 2002).

Außerdem werden AIF und Endonuklease G bei der Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran aus den Mitochondrien freigesetzt und wandern in den Zellkern, wo sie zur Chromatinkondensation im Kern und zur Fragmentierung der DNA in großem Maßstab beitragen (Cande et al., 2004; Saelens et al., 2004). Ob diese beiden Proteine vor, zusammen oder nach Cytochrom c freigesetzt werden, wird kontrovers diskutiert (Arnoult et al., 2002). Auch ist noch nicht genau geklärt, wie AIF zur Fragmentierung der Kern-DNA beiträgt, da es keine intrinsische DNase-Aktivität besitzt. In Säugetierzellen arbeitet Cyclophilin A, eine Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase, mit AIF zusammen, um den Abbau von DNA zu bewirken (Cande et al., 2004).

Unterbrechung des intrinsischen Weges bei Krebs

Mutationen in Genen, die an der Regulierung des mitochondrialen Weges beteiligt sind, sind in Krebszellen sehr häufig. Da die meisten Krebstherapien die Apoptose in Krebszellen auslösen, indem sie den intrinsischen Signalweg aktivieren, sind solche Mutationen in der Regel mit einer Behandlungsresistenz verbunden. Eine Überexpression von Bcl-2 als Ergebnis einer chromosomalen Translokation des Bcl-2-Onkogens in den Genlocus der schweren Immunglobulinkette wird beispielsweise mit etwa 85 % der menschlichen follikulären Lymphome in Verbindung gebracht (Tsujimoto et al., 1984). Experimente mit transgenen Mäusen haben gezeigt, dass die Überexpression von Bcl-2 die neoplastische Transformation von B- und T-Lymphozyten und myeloischen Zellen fördern kann (McDonnell und Korsmeyer, 1991; Traver et al., 1998).

Aus der Tatsache, dass die Überexpression von antiapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2-Familie die Onkogenese fördert, folgt, dass proapoptotische Mitglieder dieser Familie mit Multi-BH-Domäne als Tumorsuppressoren wirken. Da sich die Rollen von Bax und Bak bei der Apoptose jedoch weitgehend überschneiden, war es schwierig festzustellen, ob diese Hypothese zutrifft, und tatsächlich sind bax-/- Mäuse nicht besonders anfällig für Neoplasien (Knudson et al., 2001). Allerdings wurden somatische Mutationen, die das bax-Gen inaktivieren, bei bestimmten soliden Tumoren und hämatologischen Malignomen gefunden. Zu diesem Zweck wurden einzelne Nukleotid-Substitutionen oder Frameshift-Mutationen beschrieben, die das Bax-Gen bei Dickdarmkrebs mit Mismatch-Repair-Defizit (MMR) oder bei hämatopoetischen Malignomen inaktivieren (Rampino et al., 1997; Kitada et al., 2002).

Darüber hinaus gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass BH3-only-Proteine zur Unterdrückung der malignen Transformation beitragen können, was darauf hindeutet, dass sie als echte Tumorsuppressoren fungieren können. So wurde beispielsweise gezeigt, dass der Verlust eines einzelnen Bim-Allels die durch die Expression eines c-myc-Transgens induzierte B-Zell-Lymphomagenese beschleunigt (Egle et al., 2004), was mit der Schlüsselrolle von Bim als Regulator der lymphatischen Homöostase in Einklang steht (Strasser, 2005). Interessanterweise wurden vor kurzem homozygote Deletionen in der chromosomalen Region, die das Bim-Gen beherbergt, bei Patienten mit Mantelzell-Lymphom festgestellt (Tagawa et al., 2005). Mäuse, denen bid fehlt, entwickeln spontan eine myeloproliferative Störung, die sich zu einer malignen Erkrankung entwickeln kann, die der chronischen myelomonozytären Leukämie (CMML) ähnelt (Zinkel et al., 2003). Darüber hinaus wurde berichtet, dass die RNAi-vermittelte Unterdrückung von Puma die Myc-induzierte Lymphomagenese beschleunigt (Hemann et al., 2004).

Zusätzlich zu genetischen Veränderungen wird die abnorme Expression von Proteinen der Bcl-2-Familie meist auf transkriptioneller oder posttranskriptioneller Ebene reguliert. So wird die Expression mehrerer antiapoptotischer Proteine der Bcl-2-Familie, z.B. Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 oder Bfl-1, durch NF-κB transkriptionell reguliert (Cory und Adams, 2002).

Neben den Proteinen der Bcl-2-Familie wurde bei Eierstockkrebs, Melanomen und Leukämie eine verminderte oder fehlende Aktivität von Apaf-1 festgestellt. Darüber hinaus wirken sich Mutationen im Tumorsuppressorgen p53, dem häufigsten Gendefekt bei menschlichen Krebserkrankungen, auf den intrinsischen Signalweg aus. So werden durch die Aktivierung von p53 eine Reihe von Genen hochreguliert, die in ihren Promotoren p53-responsive Elemente aufweisen, wie die proapoptotischen BH3-only-Proteine Puma, Noxa und Bid (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Infolgedessen sind Zellen, in denen p53 stabilisiert ist, sensibilisiert für die Aktivierung des mitochondrialen Zelltodweges. Darüber hinaus kann p53 die mitochondriale Integrität direkt beeinflussen, ohne dass eine Genaktivierung erforderlich ist. Tatsächlich wurde berichtet, dass p53 an Bcl-2 und Bcl-XL in den Mitochondrien binden kann und dadurch die mitochondriale Destabilisierung fördert (Mihara et al., 2003).

Signalübertragung durch den intrinsischen Weg in der Krebstherapie

Die meisten konventionellen Chemotherapeutika, z.B. Etoposid, Doxorubicin, Cisplatin oder Paclitaxel, bewirken eine mitochondriale Permeabilisierung auf indirekte Weise, indem sie Störungen des intermediären Stoffwechsels auslösen oder die Konzentration von proapoptotischen Botenstoffen erhöhen, zum Beispiel durch Induktion der p53-Expression, durch Induktion des Ceramid/GD3-Wegs, durch Induktion des CD95/CD95L-Ligandensystems, durch Beeinflussung von Bcl-2-ähnlichen Proteinen und/oder durch Beeinträchtigung des Redox- oder Energiegleichgewichts.

Es gibt immer mehr Beweise für die Existenz eines nukleo-mitochondrialen Cross-Talks nach DNA-Schäden. So können beispielsweise apoptotische Signale, die durch DNA-Schäden entstehen, über den Tumorsuppressor p53 an die Mitochondrien weitergeleitet werden, die ihrerseits apoptotische Faktoren in das Zytoplasma freisetzen, die nachgeschaltete Zerstörungsprogramme aktivieren (Moll et al., 2005). p53 kann indirekt den mitochondrialen Weg einschalten, indem es die Expression von proapoptotischen Bcl-2-Proteinen wie Bid, Puma oder Noxa transkriptionell aktiviert (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Darüber hinaus kann p53 die Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran unabhängig von der Transkription durch direkte Aktivierung der proapoptotischen Bcl-2-Proteine Bax oder Bak oder durch Bindung und Inaktivierung antiapoptotischer Bcl-2-Proteine wie Bcl-2 oder Bcl-XL direkt auslösen (Mihara et al., 2003; Chipuk et al., 2004; Moll et al., 2005). Kürzlich wurde nachgewiesen, dass p53 in den Mitochondrien auch in vivo tumorsuppressiv wirkt (Talos et al., 2005).

Darüber hinaus besitzt Caspase-2 die Fähigkeit, als Reaktion auf DNA-Schäden den mitochondrialen apoptotischen Weg einzuschalten, indem es die äußere Mitochondrienmembran permeabilisiert und/oder die Verbindung von Cytochrom c mit der inneren Mitochondrienmembran durchbricht. Daher waren Zellen, die stabil mit Procaspase-2-Antisense transfiziert wurden oder siRNA vorübergehend exprimierten, refraktär gegenüber der Freisetzung von Cytochrom c und verschiedenen nachgeschalteten Ereignissen wie Caspase-Aktivierung und DNA-Fragmentierung, die durch DNA-Schäden induziert wurden (Lassus et al., 2002; Robertson et al., 2002). Caspase-2 kann indirekt auf die Mitochondrien einwirken, zum Beispiel durch Spaltung des proapoptotischen Proteins Bid, gefolgt von seiner Verlagerung in die Mitochondrien, um die Freisetzung von Cytochrom c zu induzieren (Guo et al., 2002). Darüber hinaus kann Caspase-2 die äußere Mitochondrienmembran direkt permeabilisieren und die Freisetzung von Cytochrom c und Smac/DIABLO stimulieren, möglicherweise als Ergebnis einer direkten Interaktion von prozessierter Caspase-2 mit mutmaßlichen Proteinen und/oder Phospholipiden, die sich in der äußeren Mitochondrienmembran oder an Kontaktstellen zwischen der äußeren und inneren Membran befinden (Robertson et al., 2004). Die Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran erfordert die Verarbeitung des Caspase-2-Zymogens, nicht aber die damit verbundene proteolytische Aktivität, und erfolgt unabhängig von mehreren Proteinen der Bcl-2-Familie, einschließlich Bax, Bak und Bcl-2 (Robertson et al., 2004). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Caspase-2 die überraschende Fähigkeit besitzt, die Verbindung zwischen Cytochrom c und anionischen Phospholipiden, insbesondere Cardiolipin, zu unterbrechen, wodurch zusätzliches Cytochrom c für die Freisetzung in das Cytosol verfügbar wird (Enoksson et al., 2004). Kürzlich wurde berichtet, dass Caspase-2 bei DNA-Schäden im so genannten PIDDosom aktiviert wird, einem Komplex aus dem p53-induzierbaren, death domain-containing protein PIDD, Caspase-2 und dem Adaptorprotein RAIDD (Tinel und Tschopp, 2004), was auf die Existenz eines nukleo-mitochondrialen apoptotischen Weges hinweist.

Außerdem wurde berichtet, dass Histon H1.2 eine wichtige Rolle bei der Übertragung apoptotischer Signale vom Zellkern zu den Mitochondrien nach DNA-Doppelstrangbrüchen spielt (Konishi et al., 2003). Das nukleäre Histon H1.2 wird nach DNA-Doppelstrangbrüchen durch einen von p53 abhängigen Mechanismus in das Zytoplasma freigesetzt und induziert die Freisetzung von Cytochrom c aus isolierten Mitochondrien in einer Bak-abhängigen Weise (Konishi et al., 2003). Eine Verringerung der H1.2-Expression verstärkte die zelluläre Resistenz gegen die durch Röntgenstrahlung oder Etoposid induzierte Apoptose (Konishi et al., 2003).

Darüber hinaus wurde der verwaiste nukleare Rezeptor Nur77 (auch bekannt als TR3) kürzlich mit der apoptotischen Bcl-2-Maschinerie in den Mitochondrien gekoppelt (Lin et al., 2004). Die Bindung von Nur77 an die N-terminale Schleifenregion von Bcl-2, die sich zwischen seinen BH4- und BH3-Domänen befindet, führt zu einer Konformationsänderung von Bcl-2, die seine BH3-Domäne freilegt, was zu einer Umwandlung von Bcl-2 von einem Beschützer zu einem Killer führt (Lin et al., 2004). Interessanterweise wurden erhöhte Konzentrationen eines Mitglieds der Nur77-Familie mit einem günstigen Ansprechen auf Chemotherapeutika bei Patienten in Verbindung gebracht (Shipp et al., 2002).

Außerdem werden bei zellulärem Stress, einschließlich Chemotherapeutika, spezifische proapoptotische Mitglieder der Bcl-2-Familie aktiviert, dereprimiert oder induziert und wirken dadurch als Sensoren. Die Aktivität der reinen BH3-Proteine wird durch mehrere Mechanismen unter Kontrolle gehalten, die diese Proteine unter normalen Umständen von den Bcl-2-Gegenspielern mit mehreren Domänen fernhalten, jedoch ihre schnelle Aktivierung unter Stressbedingungen ermöglichen (Bouillet und Strasser, 2002). Wie bereits erwähnt, stehen Proteine der Bcl-2-Familie wie Bid, Puma oder Noxa unter der Transkriptionskontrolle des Tumorsuppressors p53 und werden daher als Reaktion auf DNA-schädigende Substanzen hochreguliert (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Das BH3-only-Protein Bim, das durch Bindung an Mikrotubuli mit dem Zytoskelett assoziiert ist, wird nach einer Behandlung mit Taxol, das auf die Mikrotubuli-Assemblierung wirkt, freigesetzt und aktiviert den intrinsischen Signalweg (Sunters et al., 2003). Kürzlich wurde nachgewiesen, dass Paclitaxel die Bim-Akkumulation und die Bim-abhängige Apoptose in epithelialen Tumoren in vitro und auch in vivo auslöst (Tan et al., 2005). Aktive BH3-Proteine binden und konterkarieren antiapoptotische und aktivieren in einigen Fällen proapoptotische Mitglieder der Bcl-2-Familie mit mehreren Domänen, was zu einem Verlust der mitochondrialen Membranpermeabilität führt (Bouillet und Strasser, 2002). Wie Bcl-2-Proteine eine Störung der äußeren Mitochondrienmembran verursachen, ist noch umstritten und könnte mit der porenbildenden und selbstoligomerisierenden Fähigkeit einiger Proteine der Bcl-2-Familie, der Modulation der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore durch Proteine der Bcl-2-Familie und/oder mit Lipidveränderungen und Lipidprotein-Interaktionen innerhalb der Mitochondrienmembranen zusammenhängen. Außerdem verursachen Chemotherapeutika wie Paclitaxel eine Hyperphosphorylierung und Inaktivierung von Bcl-2 und begünstigen gleichzeitig die Öffnung der Permeabilitätsübergangspore (PT) (Ruvolo et al,

Chemotherapeutika können die Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran auch durch Veränderungen des zellulären Redoxpotentials aufgrund einer verstärkten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (oder einer Abnahme ihrer Entgiftung), einer Verarmung an reduziertem Glutathion oder einer Verarmung an NADPH auslösen oder erleichtern, da der mitochondriale Megakanal mehrere redoxempfindliche Stellen besitzt (Debatin et al., 2002). Darüber hinaus könnten Veränderungen im Energiestoffwechsel, z. B. ein Mangel an ADP und ATP, die Öffnung des Permeabilitätsübergangsporenkomplexes (PTPC) erleichtern, da ADP und ATP die physiologischen Liganden des Adenin-Nukleotid-Translokators sind, die als endogene Inhibitoren des PTPC fungieren (Costantini et al., 2000). Auch die Entkopplung oder Hemmung der Atmungskette oder die Alkalisierung der Matrix können die Permeabilisierung der Mitochondrienmembran begünstigen. Darüber hinaus können Lipid-Botenstoffe wie Ceramid, das in Zellen gebildet wird, die verschiedenen Apoptose-induzierenden Stimuli, einschließlich zytotoxischer Medikamente, ausgesetzt sind, zur Permeabilisierung der mitochondrialen Membran beitragen (Susin et al., 1997). In hohen Konzentrationen können einige Chemotherapeutika, z. B. Etoposid oder Paclitaxel, auch eine Permeabilisierung der äußeren Membran von Mitochondrien in isolierten Mitochondrien hervorrufen (Robertson et al., 2000; Kidd et al., 2002).

Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass eine wachsende Zahl experimenteller Krebsmedikamente, darunter Arsenit, Lonidamid, das synthetische Retinoid CD437 oder das Naturprodukt Betulinsäure, direkt auf Mitochondrien wirken (Debatin et al., 2002). So wurde beispielsweise berichtet, dass Betulinsäure die Apoptose auslöst, indem sie direkt den Verlust des mitochondrialen Membranpotenzials in isolierten Mitochondrien induziert, und zwar in einer Weise, die durch den Caspase-Inhibitor Z-VAD-fmk nicht beeinträchtigt wird, aber durch BA, einen Inhibitor des PTPC, oder durch Bcl-2 und Bcl-XL gehemmt wird (Fulda et al, 1998b).

Strategien, die auf den intrinsischen Weg abzielen

Proteine der Bcl-2-Familie

Da antiapoptotische Bcl-2-Proteine, die den intrinsischen Apoptoseweg wirksam blockieren, in erhöhten Konzentrationen in menschlichen Krebserkrankungen sowohl hämatologischer als auch nicht-hämatologischer Herkunft gefunden werden (Cotter, 2004), stellen sie vielversprechende Ziele für therapeutische Maßnahmen dar. Daher wurden verschiedene Strategien entwickelt, um Bcl-2-Proteine zu bekämpfen, z. B. Antisense-Techniken, BH3-Domänen-Peptide oder synthetische kleine Moleküle, die die Funktion des Bcl-2-ähnlichen Proteins beeinträchtigen. Um die Bcl-2-Expression herunterzuregulieren, wurden von Genta Incorporated (Berkeley Heights, NJ, USA) Bcl-2-Antisense-Oligonukleotidex (Genasense) entwickelt. Genasense ist ein synthetisches, 18 Basen umfassendes, einzelsträngiges Phosphorothioat-Oligonukleotid, das selektiv auf die ersten sechs Codons (d. h. 18 Basen) des offenen Leserasters der mRNA abzielt, die das Bcl-2-Protein kodiert (Cotter, 2004). Die Behandlung mit Genasense verstärkte die Antitumoraktivität vieler Chemotherapeutika, z. B. Taxane, Anthracycline, Alkylatoren oder platinhaltige Wirkstoffe (Cotter, 2004). In einem präklinischen Modell des Melanoms erhöhte die Vorbehandlung mit Genasense die Chemosensitivität des menschlichen Melanoms (Jansen et al., 1998). Auch in einer klinischen Studie wurde berichtet, dass Genasense als Chemosensibilisator für Dacarbazin bei Patienten mit malignem Melanom wirkt (Jansen et al., 2000). Um die Antisense-Therapie zu optimieren, wurden anschließend bispezifische Antisense-Oligonukleotide entwickelt, die gegen eine Sequenz gerichtet sind, die in Bcl-2 und Bcl-xL hoch homolog ist, aber in der Bcl-xS mRNA fehlt (Zangemeister-Wittke et al., 2000). Die gleichzeitige Herabregulierung von Bcl-2 und Bcl-xL induzierte Apoptose und erhöhte Chemosensitivität in verschiedenen Krebszellen (Gautschi et al., 2001; Tortora et al., 2003; Milella et al., 2004; Yamanaka et al., 2005).

Darüber hinaus wurden Peptide mit BH3-Domäne oder synthetische niedermolekulare Inhibitoren entwickelt, die auf anti-apoptotische Bcl-2-ähnliche Proteine zielen. Die BH3-Domäne besteht aus einer amphipathischen α-Helix mit neun Aminosäuren, die sich an eine hydrophobe Tasche von Bcl-2-ähnlichen Proteinen bindet (Cory und Adams, 2002). In ähnlicher Weise zielen Peptide mit BH3-Domäne darauf ab, diesen Komplex zu unterbrechen und dadurch Krebszellen für Apoptose zu sensibilisieren (Letai et al., 2002). Darüber hinaus führte die Substitution der BH3-Domäne von Bid durch nicht natürliche Aminosäuren auf der Oberfläche, die der interagierenden Region gegenüberliegt, zu stabilisierten BH3-Peptiden, die als SAHBs (stabilisierte α-Helix der Bcl-2-Domänen) bezeichnet werden und verbesserte pharmakologische Eigenschaften aufweisen (Walensky et al., 2004). Diese stabilisierten BH3-Peptide lösten bei verschiedenen leukämischen Zelllinien Apoptose aus und hemmten auch das Wachstum von Leukämie-Xenotransplantaten in Mäusen ohne nachteilige Nebenwirkungen (Walensky et al., 2004).

Außerdem wurden mehrere kleine Molekülverbindungen identifiziert, die in die Bcl-2/Bcl-xL-Funktion eingreifen. Das Screening einer chemischen Bibliothek nach Verbindungen, die an die BH3-Tasche von Bcl-2-Proteinen binden können, führte zur Identifizierung von HA14-1, einer Verbindung, die mit Bak um die Bindung an Bcl-2 konkurriert (Wang et al., 2000). Durch Screening einer Bibliothek von 16 320 vorselektierten Verbindungen auf die Fähigkeit, ein fluoreszierendes Bak-BH3-Peptid von Bcl-xL in einem Fluoreszenzpolarisationstest zu verdrängen, identifizierten Degterev et al. (2003) zwei Klassen von Wirkstoffen, die als BH3-Inhibitoren (BH3Is) bezeichnet werden und die auch den Bcl-xL-Komplex mit Bax und Bad in intakten Zellen stören.

Durch kernmagnetische Resonanz (NMR)-basiertes Screening, parallele Synthese und strukturbasiertes Design wurde kürzlich ein niedermolekularer Inhibitor der antiapoptotischen Proteine Bcl-2, Bcl-X(L) und Bcl-w, ABT-737, entdeckt. ABT-737 war als Einzelwirkstoff gegen bestimmte Lymphome und solide Tumore wirksam und zeigte eine synergistische Zytotoxizität mit Chemotherapeutika und Bestrahlung (Oltersdorf et al., 2005).

Smac/DIABLO-Agonisten

Für die Entwicklung potenziell therapeutischer kleiner Moleküle, die auf XIAP abzielen, hat die Bindungsrille der BIR3-Domäne von XIAP, an die Smac/DIABLO nach seiner Freisetzung aus den Mitochondrien bindet, die meiste Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Die Strukturanalyse hat eine klare Begründung für die Synthese kleiner Verbindungen geliefert, die die Caspase-9 verdrängende Aktivität von Smac/DIABLO aus XIAP BIR3 nachahmen können (Chai et al., 2000; Wu et al., 2000). Um die intrazelluläre Verabreichung zu verbessern, wurden Smac-Peptide an einen Träger gebunden, z. B. an das Proteintransduktionsmotiv des HIV-Tat-Proteins (Fulda et al., 2002), an die Penetrationssequenz von Drosophila antennapaedia (Arnt et al., 2002) oder an einen Polyargininabschnitt (Yang et al., 2003b). Ein Heptapeptid, das den N-Terminus von reifem Smac/DIABLO repräsentiert, der für die Bindung an XIAP wesentlich ist, fördert die Caspase-Aktivierung und sensibilisiert verschiedene Tumorzelllinien und auch primäre Tumorzellen von Patienten für die Apoptose, die durch die Ligation von Todesrezeptoren oder zytotoxische Medikamente ausgelöst wird (Fulda et al., 2002). Bemerkenswert ist, dass Smac-Peptide sogar die Antitumoraktivität von TRAIL in vivo in einem intrakraniellen malignen Gliom-Xenograft-Modell verstärkten (Fulda et al., 2002b). Ebenso konnte ein 8-mer Peptid (AVPIAQKS), das mit der Proteintransduktionsdomäne von Drosophila antennapaedia penetratin fusioniert war, in Brustkrebszellen eindringen, XIAP und cIAP1 binden und die durch eine Reihe von Krebsmedikamenten, darunter Paclitaxel, Etoposid, 7-Ethyl-10-Hydroxycamptothecin (SN-38) und Doxorubicin, induzierte Caspase-Aktivität verstärken (Arnt et al., 2002). Darüber hinaus wurden auf der Grundlage der dreidimensionalen Struktur von Smac/DIABLO im Komplex mit XIAP BIR3 Smac-Peptidomimetika entwickelt, die in Zusammenarbeit mit TRAIL, TNFα, Cisplatin oder Etoposid die Apoptose in Tumorzellen auslösen (Li et al., 2004; Sun et al., 2004a, 2004b, 2005).

In der Folge wurden nicht-peptidische niedermolekulare Antagonisten von XIAP, die durch Screening einer Phagen- oder Polyphenylharnstoff-Bibliothek gewonnen wurden, für die gezielte Bekämpfung von IAPs entwickelt (Schimmer et al., 2004; Wang et al., 2004). Darüber hinaus wurde kürzlich das Naturprodukt Embelin aus dem japanischen Ardisia-Kraut als zellpermeabler, nicht-peptidischer, niedermolekularer Inhibitor von XIAP durch strukturbasiertes computergestütztes Screening einer dreidimensionalen Strukturdatenbank der traditionellen Kräutermedizin entdeckt (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Es wurde gezeigt, dass Embelin die schützende Wirkung von XIAP in Prostatakrebszellen mit hohen endogenen XIAP-Spiegeln oder in mit XIAP transfizierten Jurkat-Zellen durch Bindung an die XIAP-BIR3-Domäne wirksam überwindet (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Smac-Agonisten oder niedermolekulare XIAP-Antagonisten könnten daher vielversprechende Kandidaten für die Krebstherapie sein, indem sie die Wirksamkeit zytotoxischer Therapien selektiv in Krebszellen verstärken.