Fluoreszierende Proteine aus A. victoria
Die spektralen Eigenschaften von GFP oder seinen Varianten liegen in der Aminosäurestruktur, die das Chromophor bildet (Abbildung 1). Dies können die drei Aminosäuren an den Positionen 65-67 oder Reste in der Nähe dieser Position sein (z.B. YFP). Neben den Hauptmutationen, die das Chromophor betreffen, wurden auch andere ortsgerichtete Mutageneseverfahren erforscht, um andere Faktoren wie die Proteinreifung und die Expression in heterologen Zellsystemen zu verbessern (z. B. Codon Usage, Proteinfaltung bei physiologischer Temperatur). Beachten Sie, dass A. victoria ein relativ primitiver mariner Organismus ohne Körperwärmesystem ist.
Auch wenn GFP wegen seiner Helligkeit und hohen Photostabilität eines der beliebtesten FPs ist, hat es zwei wesentliche Nachteile. Diese sind eine gewisse Empfindlichkeit gegenüber dem pH-Wert und eine leichte Neigung zur Dimerisierung. Dimerisierung oder Oligomerisierung ist ein Problem vieler FPs. Ihre Neigung, miteinander zu agglutinieren, kann zu Artefakten oder Fehlinterpretationen in Bezug auf Ort und Funktion des fusionierten Proteins führen. Aber auch auf dieses Problem haben die Wissenschaftler eine Antwort gefunden. Mutationen an kritischen Positionen (F223R, L221K und A206K), bei denen unpolare Aminosäuren durch hydrophile ersetzt werden, führen zu einer geringeren Dimerisierung. Alle genetischen Veränderungen, die zu einer Verbesserung sowohl der spektralen als auch der praktischen Eigenschaften führen, werden unter dem Begriff „enhanced“ FPs zusammengefasst.
Im Fall von wtGFP führen die Verbesserungen zu einem EGFP (enhanced GFP) mit einem einzigen Anregungspeak bei 488 nm anstelle des früheren komplexen Absorptionsspektrums bei 395 nm und 475 nm. Die erste mutierte Version von wtGFP (die S65T-Mutante), die von Roger Tsien et al. entwickelt wurde, war fünfmal heller als das Original und zeigte eine kürzere Reifungszeit. Zusammen mit einer besseren Reifungseffizienz bei 37°C, die auf einer anderen Mutation (F64L) beruht, spielt dies eine wichtige Rolle für Menschen, die lebende Zellen betrachten.
Eine sehr interessante GFP-Variante mit einer der größten Stokes-Verschiebungen ist Sapphire. Eine Mutation an einer Position in der Nähe des Chromophors (T203I) führt zu einer Verschiebung des Anregungsmaximums auf 399 nm und des Emissionsmaximums auf 511 nm. Dies entspricht einer Stokes-Verschiebung von 112 nm. Emerald ist eine weitere GFP-Modifikation mit verbesserter Photostabilität und Helligkeit sowie effizienterer Faltung in Säugetierzellen.
Während alle grün fluoreszierenden Proteine eine relativ hohe Helligkeit aufweisen, leiden blau fluoreszierende Proteine normalerweise unter einer geringeren Emissionsintensität bei mikroskopischen Anwendungen. Dennoch werden sie aufgrund anderer spektraler Eigenschaften in optischen Assays eingesetzt. EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein) wurde durch mehrere Runden der Mutation von wtGFP hergestellt. Bei der ersten Mutation (Y66H) wurde die Emissionsspitze vom grünen zum blauen Spektrum übersprungen. Es folgten weitere Mutationen, die ein Protein mit einem Anregungsmaximum bei 380 nm und einem Emissionsmaximum bei 448 nm hervorbrachten. Diese spektralen Eigenschaften machen es zu einem Partner für EGFP in der FRET-Mikroskopie. Neuere blau fluoreszierende Proteine mit höherer Quantenausbeute und besserer Photostabilität sind Azurite, SBFP2 und EBFP2. Ein vielversprechender EBFP-Nachfolger ist ein Protein namens Sirius, das aufgrund seiner sehr hohen pH-Toleranz (stabil von pH 3-9) und seines Rufs, das fluoreszierende Protein mit der bisher kürzesten Emissionswellenlänge zu sein, populär wurde.
Eine zweite „blaue“ Klasse von GFP-Varianten wird von cyan fluoreszierenden Proteinen gebildet: CFPs. Die Substitution von Tyrosin durch Tryptophan (Y66W) und weitere genetische Veränderungen führen zu einem Fluorochrom mit verbesserter Helligkeit und Photostabilität. Dieses ECFP hat ein bimodales Anregungs- und Emissionsspektrum bei 433/445 nm und 475/503 nm. Die Helligkeit beträgt nur etwa 40 % derjenigen von EGFP. Eine bekannte ECFP-Variante ist Cerulean, die einen höheren Extinktionskoeffizienten und eine höhere Quantenausbeute aufweist. Es ist 1,5-mal heller als ECFP und wird als FRET-Partner mit YFP verwendet.
Eine GFP-Mutation, bei der eine der drei zentralen Aminosäuren im Chromophor nicht direkt verändert wurde, führte zur Entstehung von gelb fluoreszierenden Proteinen. YFPs haben ein gemeinsames Threonin an Position 203, das durch ein Tyrosin (T203Y) ausgetauscht wurde. Diese Aminosäure ist Teil des β-Fasses und liegt in unmittelbarer Nähe des Chromophors. Im Vergleich zu GFP sind die Anregungs- und Emissionseigenschaften zu längeren Wellenlängen verschoben, mit Anregungs- und Emissionsmaxima bei 514 nm und 527 nm (EYFP). Ein Merkmal von EYFP ist seine pH-Empfindlichkeit. Bei pH 6,5 hat EYFP nur noch etwa 50 % seiner Fluoreszenz, was nicht immer ein Nachteil ist. Bei der pH-Messung (z. B. von Vesikeln, Endosomen usw.) kann EYFP als Indikator verwendet werden. Interessanterweise entwickelte eine weitere Mutation (Q69M) eine bessere Säurestabilität und eine drastisch verbesserte Helligkeit (75 % heller als EGFP). Dieses Protein, das im Vergleich zu EGFP immer noch eine schlechte Photostabilität aufweist, wurde Citrine genannt. Eine andere YFP-Mutante (F46L) zeigte eine drastisch schnellere Reifungsgeschwindigkeit und auch eine verbesserte pH-Resistenz. Dieses Protein wurde Venus genannt und ist ein häufiger FRET-Akzeptor mit Cerulean.