Die primäre Verdauungsfunktion der Galle besteht darin, die Aufspaltung und Verdauung von Fett im Lumen des Dünndarms zu unterstützen. Die Galle wird zunächst im Hepatozyten (Leberzelle) gebildet, und die Geschwindigkeit der Bildung hängt in erster Linie von der Geschwindigkeit ab, mit der die Gallensäuren in die Gallenkanäle (Canaliculi) ausgeschieden werden. Ein Teil des Gallenflusses hängt jedoch von anderen Faktoren als der Sekretion von Gallensäuren ab; insbesondere scheint er von der Natriumsekretion aus dem Hepatozyten abhängig zu sein und wird auch teilweise durch die Wirkung von Darmhormonen wie Sekretin, Cholecystokinin (CCK) und Gastrin gesteuert. Der Gesamtbestand an Gallensäuren beträgt zu jedem Zeitpunkt etwa 3 Gramm, von denen sich fast alle in der Gallenblase befinden. Auf ihrem Weg durch die Gallenwege wird die Gallenflüssigkeit durch selektive Rückresorption von Wasser, Chlorid und Bikarbonat auf ein Zehntel ihres ursprünglichen Volumens konzentriert. Dieser Konzentrationsprozess findet größtenteils in der Gallenblase statt, so dass die Galle aus diesem Organ viel dichter und dunkler gefärbt ist (aufgrund der Konzentration von Pigmenten) als die Galle aus der Leber. Die Distension des Zwölffingerdarms, insbesondere durch eine fetthaltige Mahlzeit, provoziert die Sekretion von CCK, einem Hormon, das Kontraktionen der Muskelschicht in der Wand der Gallenblase hervorruft.
Neben anorganischen Ionen (Natrium, Kalium, Kalzium, Magnesium, Chlorid und Bikarbonat) enthält die Galle Eiweiß und Bilirubin; letzteres ist verantwortlich für ihre goldene Farbe in verdünnten Lösungen und ihre dunkle Bernsteinfarbe in Konzentraten. Am reichsten ist sie jedoch an Gallensäuren (die aus Cholesterin im Hepatozyten gewonnen werden), Phospholipiden (hauptsächlich Phosphatidylcholin oder Lecithin) und Cholesterin. Cholesterin ist ein vierringiges Sterin, das mit der Nahrung aufgenommen oder von der Leber und der Darmschleimhaut synthetisiert wird. Normalerweise ist Cholesterin in wässrigen Sekreten nicht löslich und wird in Form von gemischten Aggregaten aus Komplexen, die Gallensäuren und Lecithin enthalten, in einer kolloidalen Lösung in der Galle transportiert. Fehlen ausreichende Mengen an Lecithin und Gallensäuren, kristallisiert Cholesterin aus. Die Leber synthetisiert aus Cholesterin zwei Arten von primären Gallensäuren, die Chenodesoxycholsäure und die Cholsäure. Im unteren Darm entfernen Bakterien eine der Hydroxylgruppen (Dehydroxylierung) aus der Cholsäure und verwandeln sie in Desoxycholsäure. Diese sekundäre Gallensäure erscheint in der Galle, da sie aus dem Darm absorbiert und zur Leber zurückgeführt wird. Chenodeoxycholsäure wird ebenfalls im Darm dehydroxyliert und zu Lithocholsäure umgewandelt, von der eine kleine Menge ebenfalls resorbiert wird und in der normalen Galle erscheint.