Die überraschende Entdeckung eines neuen, vom Notch-Signalprotein gesteuerten Weges öffnet die Tür für eine bessere Arzneimittelentwicklung
Von Lindsay Brownell
(BOSTON) – Jede Minute pulsiert eineinhalb Liter Blut durch das Venen- und Arteriennetz des Körpers. Die Kraft dieses Blutflusses trägt dazu bei, dass die Zellen, die die Blutgefäße auskleiden, die so genannten Endothelzellen, gesund bleiben. Wenn der Blutfluss unterbrochen wird, etwa bei chirurgischen Eingriffen oder einem Schlaganfall, beginnen die Gefäße undicht zu werden, was eine Vielzahl von Entzündungsreaktionen auslösen kann, die zu Zellschäden und Krankheiten führen. Wissenschaftler des Wyss-Instituts an der Harvard-Universität machten sich daran, das Rätsel zu lösen, wie der Blutfluss die Gefäße intakt hält, und entdeckten zu ihrer Überraschung einen völlig neuen Zellsignalweg, der ein vielversprechendes Ziel für Medikamente zur Behandlung einer Reihe von schwächenden Erkrankungen ist.
„Wir haben herausgefunden, dass das bekannte Notch-Protein dafür verantwortlich ist, dass Blutgefäße nicht undicht werden, und zwar über einen sekundären Signalweg, der ganz anders funktioniert als der bekannte transkriptionsbasierte Weg“, sagt Chris Chen, M.D., Ph.D., assoziiertes Fakultätsmitglied des Wyss Institute und Gründungsdirektor des Biological Design Center und Distinguished Professor of Biomedical Engineering an der Boston University, der der korrespondierende Autor der Studie ist. „Dieser neue Weg ist nicht nur aus der Perspektive der Entdeckung interessant, sondern könnte auch einige der Nebenwirkungen von Krebs- und Herz-Kreislauf-Medikamenten verbessern, um sie sicherer und wirksamer zu machen. Die Studie wird heute in Nature veröffentlicht.
Die Endothelzellen, die die Blutgefäße auskleiden, sind durch Verbindungen, die sogenannten Adhärens Junctions, eng miteinander verbunden und bilden eine Barriere, die das Blut im Gefäß hält und reguliert, wie leicht andere Substanzen in das Gefäß hinein- und hinausgelangen können. Um diese Barriere zu untersuchen und festzustellen, warum ein Mangel an Blutfluss sie undicht macht, bauten die Forscher ein Blutgefäß-auf-einem-Chip-Modell, das aus einem Kanal besteht, der mit einer Schicht menschlicher Endothelzellen ausgekleidet ist, die von einer extrazellulären Matrix in einem mikrofluidischen Gerät umgeben sind, was es ihnen ermöglichte, den Blutfluss durch ein Gefäß leicht zu simulieren und zu kontrollieren und die Reaktionen der Zellen zu bewerten.
Endothelzellen, die Blutfluss erlebten, zeigten eine erhöhte Aktivität des Transmembranproteins Notch1, während Zellen, die statischem Blut ausgesetzt waren, dies nicht taten. Als die Forscher eine Chemikalie hinzufügten, die die Aktivierung von Notch1 blockiert, indem sie die Ablösung seiner intrazellulären Domäne verhindert, beobachteten sie, dass das Gefäß zu lecken begann, was sie auf die Unterbrechung der Adhärensverbindungen zwischen benachbarten Endothelzellen und die Reorganisation der Aktinfasern innerhalb jeder Zelle zurückführten. Dies bestätigte, dass die Aktivierung von Notch1 durch den Blutfluss für die Bildung und Aufrechterhaltung der endothelialen Barriere der Blutgefäße notwendig ist.
Kurioserweise führte die Verhinderung der intrazellulären Domäne von Notch1, die Transkription nach der Abtrennung zu initiieren (was der bekannte Wirkungsmechanismus von Notch1 ist), nicht zum Auslaufen der Gefäße, was darauf hindeutet, dass ein anderer Teil des Proteins, dessen Funktion nicht die Transkription umfasst, auf den Blutfluss reagiert. Dieser Verdacht wurde durch In-vivo-Experimente erhärtet, bei denen die Wissenschaftler Mäusen eine Chemikalie injizierten, die Notch1 zusammen mit blauem Farbstoff blockierte, und feststellten, dass der Farbstoff viel schneller als erwartet aus den Blutgefäßen der behandelten Mäuse austrat. „Die Transkription eines Gens in ein Protein, das dann in der Zelle eine Funktion ausübt, dauert in der Regel etwa zwei Stunden, aber wir sahen ein Auslaufen innerhalb von 30 Minuten, was darauf hindeutet, dass der Prozess, der die Durchlässigkeit der Barriere steuert, über einen völlig anderen Mechanismus abläuft“, sagt Bill Polacheck, Ph.D., Bill Polacheck, Postdoctoral Fellow am Wyss-Institut und Co-Erstautor der Arbeit.
Nachdem sie festgestellt hatten, dass die intrazelluläre Domäne nicht an der Regulierung der Endothelbarriere beteiligt ist, untersuchten die Wissenschaftler andere Teile von Notch1 auf Aktivität. Sie verwendeten CRISPR/Cas-9, um verschiedene Abschnitte des Notch1-Gens zu löschen, und stellten fest, dass das Löschen des Abschnitts, der für die intrazelluläre Domäne kodiert, keine Auswirkungen auf die Permeabilität hatte, während das Löschen des winzigen Abschnitts der Transmembrandomäne (TMD) ebenfalls zu einer Zunahme der Gefäßleckage unter Flussbedingungen führte. „Dies ist das erste Mal, dass die biologische Funktion der Notch-TMD untersucht wurde“, sagt Matthew Kutys, Ph.D., Visiting Fellow am Wyss-Institut und Co-Erstautor. „In den meisten Lehrbüchern und Forschungsarbeiten wird er nicht einmal als eigenständiger Teil der Notch-Rezeptoren dargestellt. Durch weitere Tests fanden sie heraus, dass, wenn Notch1 aktiviert und seine intrazelluläre Domäne freigesetzt wird, sein TMD in der Membran einen Komplex mit den Proteinen VE-Cadherin, Rac1, LAR und Trio bildet, die gemeinsam die Adhärenzverbindungen zwischen Zellen aufbauen und aufrechterhalten und Aktinfasern gegen die Zellmembran verteilen, um diese Verbindungen zu unterstützen.
„Rückblickend betrachtet, haben wir mit diesem Projekt die Würfel rollen lassen, denn mit der Entscheidung, Notch zu untersuchen, sind wir in eines der am stärksten besetzten Forschungsgebiete der Biologie eingestiegen. Aber unser ingenieurwissenschaftlicher Ansatz ermöglichte es uns, Notch auf eine neue Art und Weise zu untersuchen, ohne den Einfluss oder die Voreingenommenheit früherer Arbeiten, und ich denke, das hat uns offen genug gemacht, um diesen neuen, unerwarteten Weg zu beobachten und zu charakterisieren“, sagt Polacheck. „Die Erkenntnis, dass Notch1 nicht nur die Zelldifferenzierung, sondern auch die Zelladhäsion reguliert, bietet auch einen neuen Rahmen für das Verständnis der Koordination komplexer zellulärer Prozesse, da einzelne Moleküle wie Notch mehrere Rollen spielen können“, fügt Kutys hinzu.
Die Erkenntnis, dass Notch1 verschiedene Funktionen erfüllt, und das Wissen darüber, welche Teile des Proteins jede Funktion steuern, ermöglicht die Entwicklung neuer Medikamente, die sowohl wirksamer als auch weniger toxisch sind. „Notch ist ein Ziel für einige Krebstherapien, aber diese Medikamente sind dafür bekannt, dass sie Ödeme und andere Probleme verursachen. Jetzt arbeiten wir aktiv daran, die beiden Wege von Notch zu trennen, damit wir Medikamente entwickeln können, die nur auf die intrazelluläre Domäne abzielen, die TMD verschonen und so die Integrität der Blutgefäße bewahren“, sagt Dr. Karen Hirschi, Professorin für Medizin und Genetik an der Yale School of Medicine, die an der Studie mitgearbeitet hat. Die Erkenntnis, dass Notch die Gefäßpermeabilität steuert, macht es zu einem Kandidaten für neue Medikamente zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, und das Team untersucht die TMD auch als potenziellen therapeutischen Wirkstoff selbst, da Zellmodelle, die einer Leck-induzierenden Entzündung ausgesetzt waren, eine drastische Verringerung der Leckage zeigten, wenn sie zur Expression der TMD gebracht wurden.
„Die Zusammenarbeit, die das Wyss-Institut zwischen so unterschiedlichen Bereichen wie Maschinenbau und Molekularbiologie ermöglicht und fördert, fördert neue Ansätze für alte Probleme, die zu wirklich paradigmatischen Ergebnissen führen können“, sagt Donald Ingber, M.D. Ph.D., Gründungsdirektor des Wyss-Instituts und Judah-Folkman-Professor für Gefäßbiologie an der Harvard Medical School und des Programms für Gefäßbiologie am Boston Children’s Hospital, der auch Professor für Bioengineering an der Harvard Paulson School of Engineering and Applied Sciences (SEAS) ist. „Diese Studie ist ein hervorragendes Beispiel für die Vorteile, die diese Art von Partnerschaften für Wissenschaft und Gesellschaft bieten können.“
Zu den weiteren Autoren der Studie gehören Jinling Yang, Ph.D., Postdoctoral Fellow am Wyss-Institut; Jeroen Eyckmans, Ph.D., ehemaliger Wyss Postdoctral Fellow und derzeitiger Gruppenleiter an der Boston University; Yinyu Wu, Doktorandin in der Abteilung für Genetik in Yale; und Hema Vasavada, Laborleiterin an der Yale School of Medicine.
Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH), der National Science Foundation (NSF), einen Ruth L. Kirchstein National Research Service Award, die Hartwell Foundation und das Wyss Institute der Harvard University unterstützt.
- VERÖFFENTLICHUNG – Nature: Ein nicht-kanonischer Notch-Komplex reguliert Adhärens-Verbindungen und die Funktion der Gefäßbarriere