Die Bedeutung der Fixierung
Um Gewebe mit dem Mikroskop untersuchen zu können, muss es konserviert (fixiert) und in Schnitte geschnitten werden, die dünn genug sind, um durchsichtig zu sein. Die Fixierung ist ein entscheidender Schritt bei der Vorbereitung histologischer Schnitte. Wird er nicht unter optimalen Bedingungen durchgeführt oder verzögert sich die Fixierung, kann eine Gewebeprobe irreversibel geschädigt werden. Unabhängig davon, wie sorgfältig die Gewebeverarbeitung, die Mikrotomie und die Färbung anschließend durchgeführt werden, sind die morphologischen und histochemischen Informationen, die aus der Probe gewonnen werden können, beeinträchtigt.
Das allgemeine Ziel der Gewebefixierung besteht darin, Zellen und Gewebebestandteile in einem „lebensähnlichen Zustand“ oder in einem Zustand zu erhalten, in dem das lebende Gewebe so wenig wie möglich verändert wird, und zwar so, dass dünne, gefärbte Schnitte hergestellt werden können. Die Wahl des Fixiermittels und des Fixierprotokolls kann von den geplanten zusätzlichen Verarbeitungsschritten und Endanalysen abhängen. Es gibt kein perfektes Fixiermittel, obwohl Formaldehyd dem am nächsten kommt. Daher gibt es eine Reihe von Fixierungsmitteln, die je nach Art des vorhandenen Gewebes und der zu demonstrierenden Merkmale verwendet werden können.
Art der Fixierung
Die Fixierung von Gewebe kann auf chemischem oder physikalischem Wege erfolgen.
Physikalische Methoden umfassen Erhitzung, Mikrowellen und Kryokonservierung (Gefriertrocknung).
Die chemische Fixierung erfolgt in der Regel durch Eintauchen der Probe in das Fixiermittel (Immersionsfixierung) oder, im Falle von Kleintieren oder einigen ganzen Organen wie der Lunge, durch Perfusion des Gefäßsystems mit Fixiermittel (Perfusionsfixierung). Für einige spezielle histochemische Verfahren wurden Fixiermittel gelegentlich in Form von Dämpfen verwendet. So können beispielsweise Paraformaldehyd und Osmiumtetroxid zur Dampf-Fixierung gefriergetrockneter Gewebe verwendet werden.
- Erfahren Sie mehr über beliebte Fixierlösungen
Mechanismus der Fixierung
Die beiden Hauptmechanismen der chemischen Fixierung sind Vernetzung und Koagulation.
Bei der Vernetzung werden sowohl innerhalb der Proteine als auch zwischen ihnen kovalente Bindungen gebildet, die das Gewebe versteifen und so dem Abbau widerstehen.
Die Koagulation wird durch die Dehydrierung der Proteine mit Hilfe von Alkoholen oder Aceton bewirkt. Diese Reagenzien entfernen und ersetzen freies Wasser in Zellen und Geweben und bewirken eine Veränderung der Tertiärstruktur der Proteine durch Destabilisierung der hydrophoben Bindungen. Dies wird auch als Denaturierung bezeichnet.
Faktoren, die die Fixierung beeinflussen
- Temperatur: Im Allgemeinen erhöht eine Temperaturerhöhung die Fixierungsrate, aber auch die Autolyse und die Diffusion von Zellelementen. Traditionell galten 0 bis 4 °C als ideale Temperatur für die Fixierung von Proben. Heute wird die Fixierung routinemäßig bei Raumtemperatur durchgeführt.
- Größe: 1-4 mm Dicke
- Volumenverhältnis: Mindestens 15-20 mal größer als das Gewebevolumen
- Dauer: 24 – 48 Stunden
- pH: Sollte im physiologischen Bereich gehalten werden, zwischen pH 4-9. Der pH-Wert für die Ultrastrukturerhaltung sollte zwischen 7,2 und 7,4 gepuffert sein.
Protokolle
- Methoden und Protokolle für die Entkalkung von Knochenmaterial
- Standardprotokoll für Formalin-fixiertes, in Paraffin eingebettetes Gewebe
Nützliche Links
- Der Prozess der Fixierung und die Natur der Fixiermittel
- Gängige Fixierlösungen
- Grundlegende Einführung in die Histologie
- Nationale Gesellschaft für Histotechnologie
- Einführung in die Entkalkung
- Praktischer Leitfaden für gute histologische Praxis